猪生殖与呼吸综合征病毒广东株ORF3和ORF5基因的克隆与分析

采用RT PCR方法扩增了猪生殖与呼吸综合征病毒广东株的糖蛋白基因ORF3、ORF5 ,并对其进行了克隆和序列分析。用Blast分析软件比较分析了其与VR 2 332株以及流行的欧洲株之间的同源性 ,并对其编码氨基酸序列的分子质量、等电点、穿膜区、糖基化位点进行了分析。结果显示 ,PRRSV广东株ORF3与美洲株的同源性达 90 % ,而与欧洲株只是在 318～ 393bp、5 0 2～ 6 97bp之间有 77%左右的同源性 ;ORF5与美洲株的同源性为 88% ,与欧洲株仅在 133～ 2 0 9bp区间有 77%左右的同源性。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN6株ORF5基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR方法从河南分离的1株(HN6)猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸中扩增缺失N端疏水序列的基因片段dORF5(deleting ORF5),并将其克隆到pMD18-T载体中测序,再亚克隆到原核表达载体pET-32a上。重组质粒转化大肠杆菌BL21,用不同浓度IPTG分别于37℃诱导,经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白的分子质量约31.4 ku,薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%。Western-blotting结果表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。证实,该蛋白可用于PRRSV的诊断。     

河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒的变异分析

为了解河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR方法对2004～2007年采集的12个典型发病场的病料样本进行了PRRSV Nsp2和ORF5基因扩增、克隆和测序,利用DNAStar和DNAMAN软件对所测序列进行了分析.结果显示,扩增的ORF5基因氨基酸序列同源性为98.7%～100%,与美洲型和欧洲型PRRSV参考株的同源性分别为88.9%～100%和62.9%～63.5%;扩增的Nsp2基因氨基酸序列同源性为82.8%～100%,与参考毒株的同源性为76.5%～100%;从2006~2007年的样本中扩增的6个PRRSV Nsp2基因均在第481位和533~561位共缺失30个氨基酸;系统进化树分析表明,这6个样本株均属于美洲型,分属于2个基因亚群,其中HB0503株与BJ4、NJ1、HN1、LP1和VR-2332遗传关系较近,其他株与JXA1、SX和BJ株遗传关系较近.结果表明,危害河北省规模猪场的PRRSV已经发生了较大的变异,其中2004～2005年的样本株属低致病性PRRSV毒株,而2006～2007年的样本株属高致病性PRRSV毒株.     

猪生殖与呼吸综合征ORF5基因疫苗的构建及其安全性和免疫原性检测

克隆了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SC2株ORF5基因。测序分析表明SC2株属美洲型PRRSV。构建的ORF5基因疫苗经脂质体转染Marc 145细胞后,第26h检测到疫苗蛋白的特异性表达,第56h达到高峰。疫苗肌肉注射小鼠和仔猪后能迅速分布到各组织器官中,未发现核酸疫苗与宿主细胞染色体整合现象;且能使仔猪产生体液和细胞免疫应答,免疫期持续135d以上。结果表明,构建的PRRSVORF5基因疫苗具有良好的安全性和免疫原性。     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的PRRSV基因组序列,设计并合成了1对特异扩增ATCC VR-2332株的ORF6基因的引物.以ATCC VR-2332基因组为模板,通过RT-PCR扩增出586 bp的cDNA产物.将该cDNA片段经T-A连接插入pGEM-Teasy载体中,用重组质粒转化大肠埃希氏菌JM109,获得重组质粒转化菌.对重组质粒DNA进行PCR及酶切鉴定,证明插入的DNA片段与PCR扩增的DNA片段大小相符.对整个ORF6进行序列分析,将测序结果与已发表的ATCCVR-2332序列相比较,证实插入片段为PRRSV VR-2332的ORF6片段的cDNA.     

广西地区2004-2010年猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5及ORF7基因的遗传变异分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子遗传进化情况,对2004-2010年间广西的PRRSV阳性病料进行了ORF5、ORF7基因扩增和序列分析。结果显示,所获得的毒株均属于美洲型毒株,其ORF5基因间的氨基酸序列同源性为89.6%～99.5%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为84.6%～91%、89.6%～95.5%和93%～99%,而与LV的同源性为54.7%～56.7%;ORF7基因间的氨基酸序列同源性为87.1%～99.2%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为91.1%～96%、91.9%～96%和89.5%～99.2%,而与LV的同源性为55.6%～58.1%。基于ORF5和ORF7基因核苷酸序列绘制的遗传进化树,可将所有PRRSV分离株分为4个亚群,广西地区的毒株分布在以CH-1a为代表的Ⅱ亚群、以HB-1为代表的Ⅲ亚群和以JXA1为代表的Ⅳ亚群,以Ⅳ亚群为主。表明当前广西PRRSV流行毒株以美洲型Ⅳ亚群为优势基因亚群,并且各毒株间的ORF5和ORF7基因序列存在一定差异,但没有明显的地域特征。     

安徽省猪生殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

从2006～2008年采自安徽省的高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒的病料中扩增得到7株PRRSV ORF5基因序列,并进行了序列分析和抗原位点预测.结果表明,安徽省的地方PRRSV流行毒株与VR-2332、CH-1a、JXA1毒株的氨基酸同源性为85.1%～86.1%、90.5%～92.5%、96.5%～98.5%;安徽省地方分离株之间氨基酸同源性较高,介于97.O%～98.5%之间.与2006年以前获得的毒株相比,安徽省流行毒株与JXA1、TZ、CXN-1等高致病性毒株具有相同的氨基酸突变位点(G9→C9、S16→F16、S35→N35、V94→A94、V185→A185),这些关键氨基酸位点的变异可能导致PRRSV毒力增强.对GP5蛋白表面抗原位点的预测发现,安徽省地方分离株与JXA1株存在6个主要抗原位点;与VR-2332、CH-1a毒株相比,由于抗原表位氨基酸位点的突变(A27→V27,L39→139,V185→A185,I189→L189)导致了抗原位点抗原性发生了变化.遗传进化树分析显示,安徽省地方流行毒株与JXA1、TZ等毒株具有较近的亲缘关系,推断2006～2008年安徽省流行的PRRSV毒株由同一毒株演化而来,且变异程度不大.     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的核衣壳蛋白基因 (N基因 ) ,并将其克隆到 pET 32a载体 ,构建了高效原核表达载体pETN。将 pETN重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌后 ,对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明 ,插入片段序列与PRRSV美洲型ATCCVR2 332株的ORF7核苷酸序列同源性达 99.9% ,与分离毒株的同源性达 99.0 %。     

猪生殖与呼吸综合征病毒NX/ZhW/07株的分离鉴定及其ORF5、Nsp2基因特性分析

将2007年宁夏送检的疑似猪高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,结果Marc-145细胞出现典型的细胞病变,应用猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,将其命名为NX/Zhw/07.采用RT-PCR方法扩增该分离株的ORF5和Nsp2基因,并进行序列分析.结果表明,NX/ZhW/07株的ORF5基因与GXHP-5、Hainan-1、HUBl、Hunan-1、JIANGSU、Jiangxi-1、LN-5和SHH-5株的核苷酸序列的同源性分别为92%～94%,其中与CH-la株的核苷酸序列的同源性最高,达99.2%.Nsp2基因序列分析显示,出现30个氨基酸的不连续缺失,与国内高热病分离株JXA1的缺失位置完全一致.由此推测NX/ZhW/07株属于PRRSV美洲型变异株.     

高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析

从广东省不同地区疑似高致病性猪生殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒,经RT-PCR检测,确定分离物中存在美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将此细胞病毒液命名为GDB1,用其感染回归5头40日龄健康仔猪,采集发病及死亡猪组织,重新用Marc-145细胞进行病毒分离,将再次分离到的病毒命名为GDB1F.对GDB1、GDB1F的Nsp2、ORF5基因序列进行测定分析.结果表明,单独感染猪2/2发病死亡,同居感染的3头猪全部发病,2头死亡;感染后2～4 d所有感染猪均出现体温升高.死亡猪表现为严重的出血性、间质性肺炎,肢体远端皮表出血.序列分析结果表明,GDB1和GDB1F株的Nsp2基因与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HN2 Nsp2、HNXT1、HNyz、HUB2、HUN1的同源性很高,达98.4%～99.0%.GDB1和GDB1F株的ORF5基因存在部分突变,没有缺失,与国内高病性PRRSV分离株JXA1、HUB2、JX0612、GDZC1的同源性高达97.5%～99.8%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Myanmar株全基因序列的测定与遗传变异分析

2010年首次从缅甸某发病猪场采集的疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and re-spiratory syndrome,PRRS)病料中分离到一株PRRSV,命名为PRRSV Myanmar株。应用RT-PCR方法分段扩增出Myanmar株的各基因片段,并将扩增产物分别连接到pEASY-T3载体并进行测序。序列测定结果表明,Myanmar株基因组全长15 411bp(不包括PolyA尾),包含10个开放阅读框,5′UTR长189nt,3′UTR长151nt。全基因序列与经典PRRSV VR2332株核苷酸序列的一致性为99.3%,与高致病性PRRSV NVDC-JXA1株核苷酸序列的一致性为89.5%。在非结构蛋白Nsp2区域并未出现特征性的30个氨基酸的缺失,而与欧洲型标准毒株(LV)核苷酸序列的一致性为54.6%。上述结果说明Myanmar株在基因型上属于经典美洲型。同时,遗传进化树分析显示,Myanmar株与PRRSV 01NP1.2株、RespMLV株、BJ-4株及PL97-1株的亲缘关系最近。     

广西区2008-2011年猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的遗传变异分析

为了解广西壮族自治区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,对2008-2011年间来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2基因的扩增和测序分析。结果显示,获得的49个毒株均为美洲型,其中46株具有高致病性变异毒株的序列特征,即其Nsp2蛋白缺失第481位和第533～561位aa,其余3株不具有上述缺失,属于PRRSV传统毒株。广西区49个毒株Nsp2基因间核苷酸序列的同源性介于84.8%～99.7%,与VR-2332、CH-1a、HB-1及JXA1株核苷酸序列的同源性分别为80.5%～83.7%、89.7%～92.6%、92.4%～96.3%、92.8%～99.3%,而与LV株核苷酸序列同源性仅为51.0%～53.9%。基于Nsp2基因核苷酸序列所绘制的遗传进化树,可将所有美洲型PRRSV毒株分为4个亚群,广西区的49个毒株有3株分布在以HB-1株为代表的Ⅲ亚群,46株分布在以JXA1株为代表的Ⅳ亚群。表明,当前广西区PRRSV流行毒株均为美洲型毒株,并且以Ⅳ亚群为优势基因亚群,各毒株间的Nsp2基因序列存在一定的差异,但没有明显的地域特征。     

猪生殖与呼吸综合征病毒5''''非翻译区序列的反向遗传操作

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR获得在病毒基因组5'非编码区(5'UTR)和ORF1起始密码子之间插入Nde Ⅰ的全长克隆pTLNd4,并以此为基础将5'UTR替换为欧洲株的5'UTR,获得全长克隆pTLV8.以体外转录的RNA转染MARC-145细胞.结果显示,pTLNd4产生了细胞病变(CPE),而pTLV8未产生.通过RT-PCR和Northern blot试验,分别对这2株突变病毒的基因组RNA复制和亚基因组mRNA转录水平进行了分析,同时还对pTLNd4进行了病毒学试验.证实,它们与亲本病毒无论从分子生物学水平或病毒学水平都无明显差异;pTLV8虽未产生CPE,但在病毒传代细胞中检测到了基因组RNA,说明替换不同基因型5'UTR的突变病毒虽然丧失了复制能力和感染性,但仍然能够提供病毒RNA合成所需要的顺式调控因子.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫学研究进展

从猪繁殖与呼吸综合征病毒的主要抗原蛋白、持续性感染、细胞免疫、体液免疫和免疫抑制几方面论述了猪繁殖与呼吸综合征病毒与宿主之间存在复杂的免疫相互作用,旨在为猪繁殖与呼吸综合征疫苗的设计与研制提供新的思路和方法。     

2006～2008年重庆部分区县PRRSV分离株ORF5和Nsp2基因的遗传变异分析

为了解重庆市PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2006～2008年分离到的14株重庆市内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和0RF5基因序列的测定和分析.结果显示,与2006年以来国内流行的变异毒株相比,Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到97.3%～99.5%和98.2%～99.7%,这2个基因推导的氨基酸序列同源性分别达到95.7%～99.2%和98.0%～99.5%.与传统毒株相比,Nsp2和ORF5基因及其推导的氨基酸都存在点突变,并在Nsp2基因内部存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失,ORF5基因未存在缺失.从遗传进化以及变异情况看,重庆市流行的PRRSV主要为变异毒株,属于美洲型中的亚群Ⅱ.