用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×105~1∶2×106;3株单抗都具有间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blotting)反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。     

猪伪狂犬病毒基因分型PCR检测方法的建立

为建立一种基因Ⅰ型和Ⅱ型猪伪狂犬病毒(PRV)鉴定方法,对PRV全基因组序列进行生物信息学分析,在Ⅱ型PRV gC基因上鉴定到一段不同于Ⅰ型PRV的47 bp长的多位点稳定差异基序.该方法能特异性区分基因Ⅰ型和Ⅱ型PRV,检测猪瘟病毒、猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型及3型时呈阴性.两种...     

猪伪狂犬病病毒环介导等温扩增检测方法的建立

针对猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计并合成了4条引物,建立了伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性地检测猪伪狂犬病病毒强毒株,不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株;该方法的最低检测量可达100个拷贝质粒DNA,比常规PCR方法的敏感性高10倍。试验表明建立的环介导等温扩增方法具有较高的特异性、敏感性和可重复性,可用于伪狂犬病病毒的快速诊断。     

伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法的建立

为建立伪结核棒状杆菌可视化LAMP检测方法,根据伪结核棒状杆菌16S rRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计2对引物,通过反应体系和反应条件的优化,建立了伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法,并评价该方法的特异性和敏感性。结果显示,本实验所建立LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h。利用该方法检测大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌等山羊和绵羊常见的15种细菌的DNA样品,结果显示仅伪结核棒状杆菌检测为阳性,其他细菌检测为阴性。该方法对阳性质粒标准品pMD19-Cory的最低检出浓度为4.7 copies/μL。应用建立的LAMP方法和普通PCR方法对128份山羊皮下脓肿样品进行检测,结果显示LAMP方法和普通PCR方法的阳性率分别为21.1%(27/128)和20.3%(26/128),2种检测方法的总符合率为99.2%(127/128)。结果表明,本研究建立的可视化LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速的优点,为山羊和绵羊伪结核棒状杆菌感染的可视化现场快速诊断提供可行方法。     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.     

免疫金层析技术快速检测副溶血弧菌方法的初步研究

应用兔抗副溶血弧菌IgG-2包被硝酸纤维素膜检测线,山羊抗兔IgG包被对照线,胶体金标记兔抗副溶血弧菌IgG-1制成检测试纸条,建立了检测副溶血弧菌的免疫金层析试纸条法(IGCA)。结果显示,阳性者试纸条检测线和对照线均出现红色线,试验过程仅需5～15min即可判断结果,该法对副溶血弧菌的最低检测量为3.592×104 CFU/mL,与溶藻弧菌、霍乱弧菌、美人鱼弧菌、麦氏弧菌、弗氏枸橼酸杆菌和沙门氏菌等常见肠道菌不发生交叉反应。将试纸条4℃存放6个月,常温存放3个月,37℃存放1个月,检测结果无差异。结果表明,建立的试纸条检测方法操作简便快速、灵敏度高、特异性强和稳定性好,非常适于基层养殖部门应用。     

用斑点金免疫渗滤试验检测牛结核分枝杆菌IgG抗体

用牛结核分枝杆菌制备牛结核菌糖脂抗原 ,并固定在NC膜上 ,将牛IgG单克隆抗体与胶体金连接。通过临床检验 ,在结核菌素皮肤试验 99例阳性牛中 ,斑点金免疫渗滤试验阳性 60例 ;皮肤试验 13 9例阴性牛中 ,金标阴性 111例。该法简便快速 ,可作为皮肤试验的辅助试验     

提纯的马立克氏病肿瘤相关表面抗原在鸡体内的免疫应答

应用木瓜蛋白酶消化法，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）人工感染鸡的淋巴细胞瘤表面提取马立克氏病相关肿瘤表面抗原（ＭＡＴＳＡ）。所获得的抗原与从肿瘤细胞表面洗脱的抗ＭＡＴＳＡ抗体在ＥＬＩＳＡ中呈阳性反应。将这种抗原与白油佐剂乳化，给２０日龄鸡肌注免疫３次。应用间接ＥＬＩＳＡ对被免疫鸡的ＭＡＴＳＡ抗体进行了监测。结果表明：免疫前正常鸡的血清中无ＭＡＴＳＡ抗体存在，而用这种抗原免疫后１０天即可形成抗体应答，ＥＬＩＳＡ的ＯＤ值（Ｘ）为０．２３，至第３次免疫后１０天，ＯＤ值（Ｘ）为０．４４。这表明从鸡ＭＤ肿瘤细胞提取的ＭＡＴＳＡ，再好鸡免疫接种后可出现明显的抗体应答。木研究结果为ＭＤ肿瘤疫苗的研制提供了重要的参考依据。     

基于PLD蛋白的伪结核棒状杆菌血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为了建立以PLD蛋白为包被抗原的伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis,Cp)血清抗体间接ELISA检测方法,以原核表达得到的重组PLD蛋白作为包被抗原,并进行特异性、敏感性和重复性试验,以及对临床样本进行检测.结果显示,重组PLD蛋白大小为33 ku,Western-bl...     

猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

为建立一种猪瘟病毒的快速检测方法,采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金,选择15 nm胶体金标记兔抗猪瘟病毒抗体,对胶体金标记抗体采用低温超速离心法进行纯化,组装免疫层析试纸条。用试纸条对猪瘟可疑病料进行检测,同时用直接荧光抗体试验和RT-PCR做平行试验。结果显示,用试纸条检测猪瘟病毒,10 min左右即可显示结果,试纸条、直接猪瘟荧光抗体试验和RT-PCR的阳性检出率依次为36.36%(4/11)、45.45%(5/11)和72.72%(8/11)。表明,用胶体金免疫层析试纸条检测猪瘟病毒操作简便,需时短,可以用于猪瘟的流行病学调查。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒间接免疫酶染色检测方法的建立

以蔗糖密度梯度离心提纯的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)免疫兔制备兔抗DHV-Ⅰ抗体,建立了检测石蜡组织切片中DHV-Ⅰ抗原的间接免疫酶染色(indirect immunoperoxidase staining,IIS)方法,并对DHV-Ⅰ强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果表明,IIS与DHV-Ⅰ感染死亡或濒死雏鸭的肝等呈现阳性反应,与鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝以及健康雏鸭的肝呈现阴性反应。感染DHV-Ⅰ死亡或濒死雏鸭的肝、脾、肾、心、胸腺、腔上囊、胰腺、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠的免疫组织化学检测呈阳性或强阳性,DHV-Ⅰ抗原主要分布于感染细胞的细胞质。该IIS法具有良好的特异性,可用于DHV-Ⅰ在感染雏鸭组织细胞中的亚细胞定位、DHV-Ⅰ感染雏鸭的实验室诊断、甲醛固定组织的回顾性诊断。     

大肠杆菌O157及其Stx2免疫胶体金层析检测方法的建立

建立了大肠杆菌O157和志贺毒素2(Stx2)的双抗体夹心免疫胶体金层析法,并运用该方法对上海市兽医生物技术重点实验室保存的已鉴定的58株大肠杆菌进行了检测,评估了其特异性、敏感性和重复性.结果显示,大肠杆菌O157层析法的敏感性为1×105CFU/mL,特异性为87.5%,批间和批内变异系数分别为8.6%和0;Stx2层析法的检测下限为200μL细菌培养液,特异性为50.0%,批间和批内变异系数分别为50.0%和33.0%.表明,该免疫胶体金层析法能快速、简便、特异地检测大肠杆菌O157;结合对Stx2的检测,能快速检出产Stx2的大肠杆菌O157菌株.     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。     

马立克病肿瘤相关抗原间接ELISA检测方法的建立

用自制并纯化的马立克病肿瘤相关表面抗原(MATSA)免疫SPF级BALB／c小鼠制备阳性对照抗体,以SPF级BALB／c小鼠血清为阴性对照抗体,筛选间接ELISA检测MATSA抗体的最佳反应条件。结果,包被液为0．1 mol／L pH 9．6的碳酸盐缓冲液,抗原包被浓度为4μg／mL,封闭液为含10 g／L BSA的PBST,抗血清稀释比例为1:800,酶标抗体稀释比例为1:1200,酶标抗体作用时间为37℃温育45 min,底物作用时间为37℃温育15 min,终止液为2 mol／L H2SO4,洗涤4次,每次1min为最佳反应条件。将建立的方法应用于MATSA单克隆抗体研制过程中阳性克隆的筛选,成功获得了MATSA的单克隆抗体,表明该优化条件为间接ELISA检测MATSA抗体的最佳反应条件。     

以免疫活性串联片段FB为抗原检测FMDV抗体的间接ELISA方法

将口蹄疫病毒免疫串联片段FB克隆至原核表达载体pBAD/TOPO中,得到重组质粒pBAD-FB,将此重组质粒转化到受体菌TOP10中,以不同浓度的阿拉伯醛糖进行诱导,并在不同诱导时间进行采样,经处理后做SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果发现以终浓度为0.02g/L的阿拉伯醛糖进行诱导,4h后表达量可达高峰,其大小约为26ku,扫描结果显示,FB融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的28.9%,能与抗FMDV抗体发生特异性反应,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。将融合蛋白的可溶性组分用500g/LNi-NTA树脂过柱纯化后作为包被抗原,成功地建立了检测血清中FMD抗体的间接ELISA方法。融合蛋白的最佳包被浓度是40μg/mL;标准阳性血清的最适稀释倍数为1∶160;最佳封闭液为50g/L脱脂奶粉和PBS;最佳封闭时间为1h。用建立的ELISA方法对采集的118份样品进行检测,并与全病毒包被抗原ELISA、间接血凝诊断试剂盒和UBIVP1抗体检测ELISA试验盒的检测结果比较,证明所建立的方法具有良好的特异性、敏感性和可重复性。     

山羊皮下脓肿病原菌三重PCR检测方法的建立与应用

为同时检测伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌3种引起山羊皮下脓肿的主要病原菌,选择针对这3种病原的特异性引物,经条件优化后建立一种可同时检测以上3种病原菌的三重PCR方法,评价了该方法的特异性和敏感性,并检测了临床样品.结果显示,所建立的三重PCR方法仅对伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌及化脓隐秘杆菌这3种目的...     

马病毒性动脉炎和马鼻肺炎抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

以基因重组抗原包被96孔板,Eu3+标记兔抗马IgG,建立了马病毒性动脉炎和鼻肺炎抗体的时间分辨荧光免疫分析检测方法,对其特异性、灵敏性、稳定性进行了分析,并与进口ELISA试剂盒和微量血清中和试验进行了比较。结果显示,该方法交叉反应不明显,特异性好,灵敏度高于ELISA方法;该方法的批内和批间变异系数分别为2.68%～4.43%和4.21%～7.25%,Eu3+标记物可稳定保存5个月以上。证实,建立的马病毒性动脉炎和马鼻肺炎抗体的时间分辨荧光免疫分析检测技术灵敏度高,特异性和稳定性好,具有很好的应用前景。     

大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染牛和小鼠排菌检测中的应用

为了检验大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染动物排菌中的应用效果,将牛和小鼠采用灌胃攻毒方式试验感染大肠杆菌O157∶H7,用大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法检测感染动物粪便中O157∶H7的排菌量和持续时间。牛在感染大肠杆菌O157∶H7后的第2天开始从粪便排菌,第4天达到峰值,排菌时间可持续28d;小鼠在感染O157∶H7后的第4小时开始从粪便排菌,第6小时达到峰值,排菌时间可持续15d。大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法的检测结果一致,但试纸条更简便、快捷、直观,1～5min可得出检测结果,便于现场检测样品中O157∶H7的快速筛查。