动物衣原体RPA检测方法的建立

为建立一种快速、准确的动物衣原体检测方法,本研究基于动物衣原体的保守基因env B的序列,设计并合成引物与探针,建立了一种动物衣原体特异性重组酶聚合酶扩增(RPA)检测方法。该检测方法在37~39℃恒温反应20 min,即可实现对动物衣原体目的基因片段的有效扩增,并具有高灵敏度的特点,最低检测限为101copies/L,同时利用建立的RPA检测方法和普通PCR方法对10份临床样品进行衣原体检测,结果阳性检出率完全一致。表明,本研究建立的动物衣原体RPA检测方法操作简单方便、灵敏度高,短时间内能获得准确可靠的诊断结果,对动物衣原体的临床检测和疾病诊断提供了一种新的、可靠的技术支持。     

鹦鹉热衣原体外膜抗原特性的研究——鹦鹉热衣原体不同纯化方法的比较试验

应用提纯物玻片姬姆萨氏染色镜检法、光学显微镜跟踪检查法、蛋白质含量紫外吸收检测法和电子显微镜技术对衣原体纯化方法作了比较研究,结果表明泛影葡胺法和改良蔗糖法优于氯仿法,用这两种方法提取的衣原体纯度高,颗粒形态清晰,结构完整,背影杂质少,提取的衣原体蛋白质浓度高。泛影葡胺法和改良蔗糖法可用于鸡胚中增殖的鹦鹅热衣原体的纯化。     

奶牛流产衣原体OmpA抗原间接ELISA检测方法的建立

以奶牛流产衣原体外膜蛋白A(OmpA)作为抗原,筛选最佳反应条件,建立了奶牛衣原体病间接ELISA检测方法。结果显示,OmpA的最佳包被浓度为1∶320;血清最佳稀释度为1∶40;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;抗原的最适包被条件为37℃1h加4℃过夜;ELISA的阴性、阳性临界值为0.391。用本方法和衣原体间接血凝试验检测奶牛血清田间样品206份,两者的符合率为95.3%。本试验建立的OmpA-ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,可为牛衣原体病的诊断及流行病学调查提供有效工具。     

家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测家畜嗜衣原体,选取家畜嗜衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因的高度保守区域,设计特异性引物和探针,通过对反应条件的优化,建立家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的最低检测限为2.8×10copies/μL,在2.8×102~2.8×106 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其标准曲线方程为y=-3.281 5x+41.396,线性相关系数r2=0.999 4,扩增效率为101.7%;该方法可特异性检测家畜嗜衣原体,对肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体等6种动物衣原体无交叉反应,特异性好;其批间重复试验和批内重复试验的变异系数分别为0.170 2%~0.467 2%、0.331 4%~2.796%,重复性良好。采用本试验建立的方法与OIE推荐的方法进行比较,二者的结果表现出良好的符合率。该方法的建立为家畜嗜衣原体的早期检测和流行病学调查提供了有效的检测手段。     

沙门菌夹心DNA杂交检测方法的建立

为建立简便快速、特异检测沙门菌的方法,根据沙门菌invA基因序列,分别设计特异的捕获探针和检测探针,通过探针与目标rRNA结合,优化反应条件,建立了检测沙门菌的夹心DNA杂交方法。该方法在1.5h内即可完成全过程检测,加入TMB显色液可直接肉眼观察结果或采用酶标仪测定D450nm值判定结果。该方法对其他相关病原菌均无特异性反应,最低检测限为1.2CFU/mL,具有良好的精确度。批内变异系数在16.53%~17.97%之间,批间变异系数在16.33%~22.10%之间。本方法的建立为沙门菌的大批量、快速检测和防控提供了新的技术手段。     

牛白血病病毒前病毒DNA荧光PCR检测方法的建立及应用

为快速检测牛外周血淋巴细胞中的牛白血病病毒(bovine leukem ia vir,uBsLV)前病毒DNA,选取BLVenv基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立检测牛白血病前病毒DNA的荧光PCR方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价及实际样本的验证检测。结果显示,该方法具有很高的特异性和重复性,最低检出限为每个反应可检出3个拷贝数的阳性标准质粒对照。在175头BLV抗体阳性牛中,用该方法共检出127头BLV感染牛。在262头BLV抗体阴性牛中,用该方法检出2头BLV感染牛,该方法与套式PCR之间检测结果的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的方法可用于BLV感染牛的确证。     

集约化猪场猪衣原体血清抗体的检测

用间接血凝试验对广东3个大型集约化猪场进行衣原体病血清学调查,共检测286份血清,总阳性率35.3%,其中仔猪、生长肥育猪及母猪的阳性率分别为15.6%、25.8%和47.4%,XG猪场有流产、死产史母猪的阳性率(69.4%),显著高于正常经产母猪(45.5%);结合生产中存在的问题分析,认为衣原体病对广东集约化猪场母猪繁殖及其他猪的发育、生长已造成一定的危害.     

乳牛布鲁氏菌病病原DNA快速检测技术的研究

在国内首次建立了乳牛原乳中布鲁氏菌外膜蛋白(OMP)25 ku基因套式聚合酶链反应(nested-PCR)检测技术。结果显示,本方法的特异性好,只能扩增布鲁氏菌DNA,而不能扩增同样能引起乳牛流产的鹦鹉热衣原体、弓形虫、胎儿弯杆菌DNA;乳样的检测灵敏度达50 CFU/mL,重复试验35次,可重复性和稳定性均十分理想;对 4 批 331 头凝集试验阳性(24 份)或阴性(307 份)乳牛的乳样用本方法检测,符合率为100%。在48 h内即可获得诊断结果。本方法同样可用于血液或其他流产病料中布鲁氏菌DNA的检测。     

云南省红河州鸡衣原体感染的血清学检测

云南省红河州鸡衣原体感染的血清学检测王琼秋，刘伯庶（云南省红河州畜牧兽医站蒙自６６１１００）１９９４年１１月，红河州部分商品肉鸡场陆续发生鸡的衣原体病并造成严重的经济损失。为了解本病在我州的感染情况和提出有效的防治措施，我们对个旧、开远、建水、屏边、...     

青海省班玛县牦牛衣原体病血清学检测

青海省班玛县牦牛衣原体病血清学检测董才行，张乃忠（青海省果洛州畜牧兽医研究所玛沁８１４０００）张安岁，刘滋泽，田生珠，李生福（班玛县兽医站）班玛县地处青海、四川交界处，东、南、西分别与四川省阿坝、壤搪、色达等地区交错接壤，疫值复杂，其中牦牛流产一直是...     

隐孢子虫PCR检测中模板DNA提取方法比较

用4种不同方法抽提隐孢子虫卵囊DNA作模板,以1对人工合成的寡聚核苷酸为引物进行聚合酶链反应,均能扩增出540 bp特异性DNA片段;比较这4种方法的操作过程和卵囊最低检测量对它们进行综合评价,其中20 g/L二硫苏糖醇冻融法最佳,具有敏感、简便、快速等优点.     

甘肃省部分猪场猪衣原体血清抗体的检测

用间接血凝试验对甘肃省 7个市 (地 )的部分猪场猪群用间接血凝试验进行衣原体血清抗体检测。共检测 4 68份猪血清 ,阳性 161份 ,可疑 5 1份 ,总阳性率为 34.4 0 % ,其中武威市为66.67% ,平凉市为 5 6.2 5 %     

驻甘青部队牧场羊衣原体病的血清学检测

羊衣原体病是由鹦鹉衣原体(Chlamydiapsittaci)引起的一种人畜共患传染病,不同年龄、性别的绵羊、山羊均可感染发病。为了摸清军牧场畜群中羊衣原体病的流行情况。我们于1987～1989年,在畜禽疫病普查中,对驻甘肃、青海两省部队的羊群抽样进行了羊衣原体病的血清学检测。(一)材料与方法1.检验试剂与标准阳、阴性对照血清:均系中国农科院兰州兽医研究所提供。(1)间接血凝试验冻干抗原(致敏红细胞),批号:8803。     

食品中沙门氏菌DNA环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据沙门氏菌属高度保守的fimY基因序列设计了2对特异性引物,采用环介导等温扩增方法(LAMP)建立了食品中沙门氏菌的LAMP快速检测方法。结果表明,建立的LAMP方法具有高度特异性,经对40种共68株细菌进行扩增,所试32株沙门氏菌均为LAMP阳性,其他菌株为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的沙门氏菌的检测灵敏度为5CFU/管,对污染食品中沙门氏菌的检测灵敏度为9CFU/管,60min内即可完成检测。用建立的LAMP方法对802份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出165份LAMP阳性样本,与国标(GB/T4789.4-2008)方法的检测结果一致。建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

羊衣原体性流产病的防治方法简介

羊的衣原体性流产是由鹦鹉衣原体(Chla-mydia psittaci)引起的一种传染病,世界上许多国家都发现存在有此种病,它不仅对畜牧业的发展造成巨大危害,同时也造成很大的经济损失,例如在英国,每年由于此病原引起羊衣原体性流产所造成的经济损失可达2000万英镑左右;在我国,许多省区都证实有此病的存在,特别是在牧区流行范围更大,有的牧区羊只由衣原体引起的流产率高达     

猪传染性胃肠炎病毒重组核蛋白的纯化与Dot-ELISA抗体检测方法的建立

将重组猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)N基因原核表达载体pProEXHTb转化的大肠埃希氏菌 ,用IPTG诱导表达核蛋白 ,经过Ni NTA柱的纯化 ,获得纯化核蛋白。以该蛋白制备抗原 ,建立了以TGEVN蛋白重组抗原的Dot ELISA诊断技术 ,其抗原最适包被量为 1μg ,抗原预点膜在 4℃可保存 5周以上。本法快速简便 ,适合基层进行抗体检测     

DNA荧光染色法检测霉形体

ＤＮＡ荧光染色法检测霉形体韩国珍，王巧全，胡永强（上海动植物检疫局２０００３２）细胞培养中霉形体污染现象是相当普遍的，不但影响细胞的生长，而且引起细胞病变，改变细胞的生物学特性。因此，在细胞培养中一方面要采取措施严格控制污染，另一方面对细胞特别是对引...     

应用免疫电镜技术观察羊流产衣原体

本实验应用免疫电镜技术(IEM)吸附法、装饰法、吸附和装饰结合法以及沉淀法检测羊流产衣原体,并以直接法做对照。实验结果表明,这4种方法适用于检测羊流产衣原体,处理的样品在电镜下均较直接法处理的样品清晰,对于观察羊流产衣原体的形态以及对本病的诊断都有较高的实用价值。(一)材料和方法1.材料:羊流产衣原体(黄株)鸡胚卵黄囊培养物磨碎稀释经差速离心提纯,制成衣原体悬液。羊衣原体阳性血清批号8806,补体结合效价为1:256。阴性血清。上述材料均由我所羊衣原体研究课题组提供。     

鹦鹉衣原体病的临床诊断及治疗

1987年元月,从云南省中缅边境城镇集市上收购大绯胸鹦鹉2只、小绯胸鹦鹉和灰头鹦鹉77只,共计79只,在我园隔离饲养、检疫,第5天时发病,经临床及实验室检查,诊断为鹦鹉衣原体病。临床症状 患病鹦鹉精神沉郁,不爱活动,被毛松乱、逆立,食欲减退,消化不良,部分鹦鹉有呕吐现象,并有“咯咯”的呼吸音,数天后有死亡者。     

DNA疫苗体外与体内表达及鉴定方法的建立

为了确定作为疫苗的质粒DNA能否在真核细胞中表达和探讨其是否有可能和宿主DNA发生整合,基于弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-GRA6建立了鉴定DNA疫苗在真核细胞内表达以及其是否与宿主DNA重组的方法。以黄色荧光蛋白为标记优化DNA疫苗体外转染真核细胞的最佳条件,然后通过RT-PCR和Western-blot方法对目的蛋白GRA6的表达进行了鉴定。DNA疫苗免疫小鼠后,在不同时间点用PCR方法检测质粒DNA在体内组织样本中的分布,探讨了质粒DNA是否能与宿主DNA发生整合。结果显示,弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-GRA6在质粒DNA与转染试剂的比例为1∶8时体外转染效果最好,RT-PCR和Western-blot方法均证明其可以在真核细胞中表达。免疫后第28天,pcDNA3.1-GRA6免疫组小鼠的脾、肝等组织的基因组DNA样品均可扩增出GRA6基因片段;而免疫后第56天,各组织均未扩增出特异性GRA6基因片段。表明质粒DNA只能短暂存在于体内。因此,DNA疫苗重组质粒体外与体内鉴定方法的建立,为DNA疫苗开发提供了一个较为系统的研究基础。