莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚体内外抗弓形虫RH株速殖子的效果分析

通过弓形虫RH株速殖子在宿主体内和体外的感染试验,比较了莫能菌素钠、磺胺嘧啶和蒿甲醚的抗弓形虫效果。体外试验:用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,评价了3种不同浓度的药物对人包皮成纤维细胞(HFF)毒性及增殖情况;在药物的安全浓度范围内,用5×10~4个弓形虫RH株速殖子感染5×10~5个HFF细胞,每种药物设置5个浓度梯度,培养48 h后观察药物体外抑制虫体在细胞内的增殖效果;以相对抑制率为指标,评估药物的体外抗弓形虫效果。体内试验:用5×10~4个弓形虫RH株速殖子接种小鼠,4 h后,3种药物分高中低剂量组进行灌胃给药,连续给药5 d后停药,观察并记录小鼠每天死亡情况;且每天每组随机抽取1只小鼠,检查腹腔液中速殖子量及停药后是否复发,评价药物体内抗弓形虫效果。体外试验结果表明:莫能菌素钠可显著抑制细胞内弓形虫的增殖,效果优于蒿甲醚,而磺胺嘧啶的效果波动性较大。体内试验结果表明:莫能菌素钠显著延长小鼠平均存活时间,磺胺嘧啶次之,蒿甲醚最次。体内和体外试验结果均显示出莫能菌素钠能显著抑制弓形虫速殖子增殖,延长小鼠存活时间。本研究为后续抗弓形虫药物研究以及临床用药提供了参考依据。     

猪弓形虫病特异PCR诊断方法的建立

以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,建立了猪弓形虫病特异PCR诊断方法。应用人工感染的方法建立了猪弓形虫病动物模型,摸索出猪弓形虫病PCR检测的最佳条件。敏感性和特异性试验结果显示,该PCR方法最低能检测到10 个弓形虫速殖子的DNA,且与相关的8种原虫和线虫均无交叉反应,证明该PCR方法具有高度的敏感性和特异性。动物感染试验结果证明,在试验猪出现明显临床症状时(感染后第5 d),对取材的8 个组织样品用该PCR方法检测,有6个组织样品为阳性,其中检出率最高的组织为肺门淋巴结。     

弓形虫单克隆抗体试剂的研究——单克隆抗体微量反向间接血凝试验

本文首次报道用杂交瘤细胞株3C_2分泌的抗弓形虫单克隆抗体腹水经饱和硫酸胺盐析纯化后致敏绵羊红细胞而建立了弓形虫微量反向间接血凝试验。结果表明:它可检测出含量仅为5μg/ml的弓形虫速殖子可溶性抗原,并且在弓形虫QHO株速殖子感染绵羊和家兔之后的2～6天,血清中即能检测到循环抗原;与正常绵羊、家兔和小白鼠的血清以及其它寄生虫感染的动物血清无非特异性反应和交叉反应;试剂经冷冻真空干燥处理后其活性不受影响,且至少能保存3个月之久。从而为早期弓形虫感染和现症急性感染等提供了一种特异性强、灵敏度较高和简便实用的诊断方法。     

鼠巨噬细胞Ana-1培养弓形虫RH株速殖子的特性研究

为比较鼠巨噬细胞Ana-1(吞噬细胞)和Vero细胞(非吞噬细胞)培养弓形虫RH株后虫体以及虫体和宿主细胞间的表现,采用一般形态学观察、流式细胞术检测弓形虫接种后Ana-1细胞和Vero细胞的凋亡和坏死情况,并用NO检测试剂盒检测Ana-1细胞的NO分泌量.结果显示,弓形虫能够在两种细胞上大量发育和繁殖,而且两种细胞凋亡和坏死并存,Ana-1细胞以坏死为主(坏死率为58.6%,凋亡率为12.6%),Vero细胞则以凋亡为主(坏死率为28.7%,凋亡率为56.0%).对NO的检测显示,含100 mL/L小牛血清培养的Ana-1 NO分泌浓度为0.16～0.17 μmol/mL;而感染弓形虫速殖子的Ana-1 NO分泌浓度为0.18～0.46μmol/mL,两者差异显著(P＜0.05).证实,应用Ana-1和Vero细胞培养弓形虫均可获得大量虫体;弓形虫感染后吞噬细胞和非吞噬细胞的凋亡率和坏死率不同,差异极显著(P＜0.01);弓形虫感染能够诱导Ana-1分泌NO.     

感染弓形虫的肉鸡的临床症状及病理变化

为观察鸡感染弓形虫后的临床症状及组织器官的病理特点,以弓形虫GJS株速殖子人工感染鸡,然后在不同时间剖杀,观察其组织器官病理变化;取内脏组织器官,浸泡于100mL/L中性福尔马林溶液中,运用常规HE染色观察其病理变化特点,并用免疫组织化学检测组织中弓形虫速殖子。结果显示,鸡感染弓形虫后出现精神沉郁、食欲不振、形体消瘦、跛行、拉稀等临床症状。解剖发现,被感染鸡肝肿大,肺发炎,胸、腹腔液增多,心肌变性,脾肿大,肠道出血。HE染色观察发现,肺的病理变化尤为明显,出现出血、充血;肝汇管区增大,有炎性细胞浸润;脾出血、充血,出现弥漫性增生;大脑中纤维组织增生,脑细胞减少。说明鸡感染弓形虫速殖子后能产生比较明显的临床症状和病理变化。     

分泌抗弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立——体外免疫法制备免疫脾细胞

作者用纯化弓形虫速殖子可溶性抗原体外免疫BALB/C小鼠的正常脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,经ABC—ELISA和IHA筛选和3次克隆化培养后获得了1株分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞(E5)。E5杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经琼脂双扩散免疫试验确定为IgGl亚类抗体。单克隆抗体的抗原吸收试验结果证明E5单克隆抗体为抗弓形虫特异性抗体。E5杂交瘤细胞的染色体数目为92～108,经连续30代传递培养和4个月冻存复苏试验证明其分泌特异性单克隆抗体的性能相当稳定。初步证实E5单克隆抗体针对一种弓形虫的共同抗原成份。     

抗弓形虫MIC3单抗的制备及其在速殖子免疫荧光观察中的应用

为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定分泌抗MIC3单抗的分泌株:4G1、1G12和5D7;经测定,3株MIC3单抗4G1、1G12和5D7的亚型分别为IgG1、IgG2b、IgG2b,效价分别为1∶3 200、1∶12 800、1∶1 600。筛选得到的2株MIC3单抗(4G1和1G12)可用于间接免疫荧光检测MIC3蛋白在虫体中的分布。通过弓形虫阳性感染猪血液样品推片的免疫荧光试验,验证了这3株单抗具有特异性。结果表明,研制的MIC3单抗和虫体荧光观察体系可用于速殖子MIC3蛋白在虫体表达定位和其他研究,也可作为其他速殖子抗原荧光观察的比较对象。     

绵羊感染强毒弓形虫的胴体及内脏的无害化处理

弓形虫病(Toxoplasmasis)是一种宿主动物很多,分布地域很广的人畜共患原虫病。羊群感染之后,会出现发热、眼底损伤、生长发育受阻、产毛产奶减少、流产或早产,并垂直传播引起新生羔的弓形虫病,影响养羊业的发展。 本实验的目的在于通过对感染羊胴体和内脏的无害化处理,以消除胴体和内脏中弓形虫速殖子或包囊的感染性,达到食用卫生标准,有效预防弓形虫病的流行。     

弓形虫自然弱毒株毒力稳定性及生物学特性的研究

研究结果表明:①用弓形虫自然弱毒株(QHO)包囊继代繁殖的速殖子和经不间断连续20次继代的速殖子10~2～10~7虫量分别感染小鼠,进行稳定性试验。前者不致死小鼠,并可持续存活30～150天以上,后者可在6～11天使小鼠全部致死,表现与RH株毒力相同。继之,将毒力变异和未变异的速殖子分别经-196℃液氮冻存4～9个月,复苏后感染小鼠,仍表现各自毒力特性。②用不同剂量的QHO株包囊(1～100个)和速殖子10~4分别腹腔感染小鼠观察虫体消长规律,二者在腹液中都可形成大量速殖子,同时在10～14天逐渐消失,通过镜检和盲传证明虫体在腹液中不复存在。继经21天左右在脑组织中形成大量包囊,终生存留。③温度敏感性和低温保存期的观察:包囊在4℃12天、-12℃和-25℃5天、56℃5分钟均不再具有感染性;速殖子4℃27天仍具有感染性;而经-196℃液氮中长期保存的包囊和速殖子都可成功地复苏,并具有各自的毒力和致病性。     

弓形虫Ⅰ型蛋白磷酸酶基因的原核表达及蛋白的定位研究

为表达刚地弓形虫Ⅰ型蛋白磷酸酶(Toxoplasma gondii protein phosphatase 1,Tg PP1)基因、确定Tg PP1在弓形虫速殖子上的定位,将全基因合成的Tg PP1基因克隆到表达载体p ET-30a(+)中,构建重组载体p ET30a-Tg PP1,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导,利用SDS-PAGE和Westernblot检测重组蛋白表达情况及其免疫学活性。通过亲和层析获得Tg PP1重组蛋白,制备抗血清,采用间接ELISA检测血清效价、免疫荧光法检测Tg PP1蛋白在弓形虫中的定位。结果显示,成功构建了重组表达载体p ET30a-Tg PP1并实现了在大肠杆菌中的表达,表达产物的分子质量约为36 ku。Western-blot检测结果显示,重组蛋白能与弓形虫感染小鼠阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。免疫荧光检测结果显示,Tg PP1主要定位于弓形虫速殖子顶端。上述结果为进一步研究Tg PP1在弓形虫入侵和繁殖过程中的作用及其机制打下了基础。     

五种中草药对弓形虫体外增殖的抑制效果

探索治疗弓形虫病的有效药物组方,从而为临床合理用药提供科学的指导,通过体外试验,培养Ana-1细胞作为弓形虫宿主细胞,采用MTT法测定了甘草、黄芩、百部、苦参和贯众5种中药对细胞的安全浓度,将弓形虫RH株速殖子与Ana-1细胞在含不同浓度药物的细胞培养液中共同培养,在加药后第4、8、12、24、48小时,观察细胞和弓形虫的生长状态和形态,选取第48小时观察药物体外抑制虫体增殖的效果,并以磺胺嘧啶钠作为阳性药物对照。结果显示,黄芩、百部、甘草可显著抑制弓形虫的增殖,而贯众和苦参效果不佳。     

华南地区黑冠松鼠猴(Saimiri vanzolinii)弓形虫虫株的分离鉴定

采用基于弓形虫虫株529 bp重复序列的PCR方法对采集的病料进行弓形虫分子鉴定。将该弓形虫阳性病料匀浆接种于BALB/c小鼠腹腔,经连续传代分离获得弓形虫速殖子。同时,根据弓形虫B1基因的PCR方法对该分离虫株进行鉴定,扩增出弓形虫B1基因特异条带。测序结果表明,此虫株扩增片段基因序列与GenBank中的弓形虫B1(AF179871)基因序列完全一致。通过PCR-RFLP分型鉴定,所分离的SS弓形虫虫株与传统Ⅰ型RH株、Ⅱ型PRU株和Ⅲ型VEG株的酶切谱系均有所不同,同时与Chinese#1型也有所不同,其被判定为国内另一种独特基因型弓形虫虫株,这为国内乃至华南地区弓形虫基因库的建立收集了样本,也为下一步野生动物弓形虫检测和防控提供了依据。     

TLR3参与新孢子虫致怀孕小鼠胎盘的炎性损伤

为探究TLR3是否参与了新孢子虫致小鼠胎盘的炎性损伤,本试验将2×106新孢子虫Nc-1株速殖子通过腹腔注射给怀孕7.5 d的C57BL/6小鼠,利用病理组织切片、免疫组化和荧光定量PCR等方法检测小鼠胎盘组织中TLR3及其相关细胞因子表达水平.结果显示,在小鼠感染新孢子虫后第2、5、8d小鼠胎盘组织分别出现了不同程度...     

桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞亚群的影响

将40只昆明种小鼠随机分成4组:空白对照组、阴性对照组、蒿甲醚组和桦褐孔菌多糖组,每组10只.每组小白鼠腹腔接种弓形虫RH株速殖子1 × 102个,建立小鼠急性弓形虫感染模型.采用流式细胞仪检测脾中CD4+、CD8+T细胞百分数及CD4+/CD8+T细胞比例,探讨了桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的影响.结果显示,桦褐孔菌多糖组中CD4+T细胞百分数及CD4+/CD8+T细胞比例与其他3组比较差异极显著(P<0.01);阴性对照组CD8+T细胞百分数显著高于桦褐孔菌多糖组(P<0.05),与其他2组比较差异极显著(P<0.01).结果表明,桦褐孔菌多糖可有效调节感染弓形虫小白鼠的CD4+T细胞百分数及CD4+/CD8+比例,达到抗弓形虫目的.     

复方蒲公英对金黄色葡萄球菌耐药质粒的体外消除试验

通过以复方蒲公英注射液为消除剂、十二烷基硫酸钠为对照组消除剂,以从患有乳腺炎乳牛的乳汁中分离的多重耐药菌株为靶细菌进行耐药质粒体外消除试验,用质粒DNA抽提与琼脂糖凝胶电泳方法观察复方蒲公英注射液对该耐药菌株质粒的影响,探讨了复方蒲公英注射液作为消除剂的可能性。结果显示,复方蒲公英注射液对耐药金黄色葡萄球菌作用24h,其1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的消除率分别为2%、2.6%、3.6%,延长作用时间至48h,其1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC的消除率分别为2.8%、3.6%、4.4%。证实,复方蒲公英注射液对金黄色葡萄球菌耐药质粒有消除作用,可用于临床治疗耐药金黄色葡萄球感染。     

弓形虫中含WD40结构域蛋白TGME49＿228400的生物学功能研究

利用CRISPR/Cas9技术成功构建了弓形虫Ⅱ型Pru虫株的TGME49＿228400定位株和缺失株（PruΔ228400）,研究了TGME49＿228400在弓形虫中的亚细胞定位和基本生物学功能。Western-blot结果显示TGME49＿228400蛋白大小为69.9 ku。间接免疫荧光检测显示,TGME49＿228400定位于顶质体,TGME49＿228400缺失后对弓形虫顶质体的形态无影响。与Pru野生株相比,TGME49＿228400缺失株形成噬斑和增殖的能力均显著减弱（P<0.01）,而入侵、逸出、体外缓殖子转化能力和对小鼠的毒力无显著差异（P>0.05）。本研究结果可为后续阐明弓形虫中其他含WD40结构域蛋白的功能和作用机制奠定基础。     

柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶特性分析

为了研究柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶(EtNADP-GDH)的分子特性,对该基因进行了克隆和生物信息学分析,利用间接免疫荧光定位、体外入侵抑制、实时荧光定量PCR、Western-blot和体外酶活性检测等方法分析其生物学特性。结果显示,成功获得了EtNADP-GDH基因,该基因编码的蛋白富含包括NAD结合位点在内的多种功能位点。该蛋白主要分布在虫体的表面和细胞质中,抗rENADP-GDH多克隆抗体能抑制子孢子入侵DF-1细胞,抑制率约为45%,表明其参与了虫体入侵宿主细胞。荧光定量PCR结果显示,该基因在未孢子化卵囊阶段的转录水平最高;转录、翻译水平分析发现,与敏感株相比,2个耐药株(地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株)中EtNADP-GDH的转录水平显著提高,而翻译水平无明显差异;酶活性分析结果显示,耐药株和敏感株差异不明显。结果表明,该蛋白可能对虫体在宿主细胞内的生长发育起作用并参与了子孢子入侵宿主细胞的过程。     

金丝桃素体外抗传染性支气管炎病毒的研究

将不同浓度的金丝桃素和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)以三种方式加入鸡胚肾细胞(CEK)培养体系中,采用细胞病变效应(CPE)法、MTT法、病毒滴度法、实时荧光定量PCR以及间接免疫荧光技术检测金丝桃素体外抗IBV作用,同时检测其对IBV诱发细胞凋亡的影响。结果显示,金丝桃素在CEK细胞感染IBV前、后及同时加入,都有明显抑制CPE的作用;随着添加药物浓度的增加,CEK细胞活力明显增高,病毒TCID50滴度、病毒核衣壳蛋白RNA相对表达量和CEK细胞中病毒阳性绿色荧光信号显著降低或减少(P0.01),并且呈现明显的剂量依赖性。三种给药方式以药物和病毒互作后同时加入效果最好。IBV可以引起CEK细胞凋亡的发生,添加金丝桃素能够抑制病毒引起的凋亡。上述试验结果表明,金丝桃素具有很好的抗IBV作用,其作用可能是通过抑制感染细胞凋亡产生的,这可能是金丝桃素抗IBV的作用机制之一。     

泰氏锥虫体外药物筛选的研究

通过体外培养技术大量繁殖泰氏锥虫,选用抗原虫药拜尔205、贝尼尔和咪唑苯脲,抗生素青、链霉素和两性霉素B分别以不同浓度作用培养虫体,观察不同药物对虫体的杀伤和抑制作用。试验结果表明,两性霉素B对泰氏锥虫杀伤作用最强,当营养液内最终浓度为2.5ug/ml时,对虫体即表现极强的杀伤和抑制作用,最终浓度增加到25ug/ml时,则可杀死全部虫体。其次为咪唑苯脲,当营养液内最终浓度为1OOug/ml时,对虫体呈现很强的杀伤和抑制作用,最终浓度增加到1000ug/ml时,则可杀灭所有虫体。两性霉素B和咪唑苯脲对细胞均无毒害作用。青、链霉素最终浓度在250单位/ml或以下时,对虫体和细胞均无抑制和损伤作用,可作为泰氏锥虫体外培养时良好的抗杂菌污染剂。贝尼尔对泰氏锥虫有轻度的抑制作用,拜尔205对培养泰氏锥虫无损伤作用,两者对培养细胞均呈现明显的毒害作用。两性霉素B和咪唑苯脲对人工感染小鼠的伊氏锥虫无抑制和杀伤作用。     

猪链球菌2型对红细胞的黏附及溶血作用

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)感染过程中对血液红细胞(RBC)损害及其机理,本研究采取无特定病原微生物感染的猪血液制备RBC悬液,根据预试验选用SS2∶RBC感染比(MOI)为100的SS2,分别体外感染RBC 0.5、1、1.5、2 h,光镜下观察BRC的形态变化;用G iem sa染色、CF D A-SE荧光标记检测SS2对红细胞的黏附和损伤,流式细胞仪分析不同作用时间的黏附率,real-time PCR检测SS2相关黏附因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、荚膜多糖(CPS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、纤连蛋白和纤维蛋白结合蛋白(FBPS)及溶血因子溶血素(Sly)的转录水平。结果显示,SS2感染后第0.5~1小时,其主要黏附RBC,细胞呈现棘突样病变,少量细胞肿胀,出现轻微溶血,黏附率分别为18.7%和46.3%;感染后第1.5小时,SS2不仅可以黏附RBC,且多数细胞溶血,RBC开始发生破裂,黏附率可达到91.7%;感染后第2小时,细胞几乎全部破裂。MRP和CPS2J转录水平在感染后第0.5~1小时增高,并与黏附率呈正相关,感染后第2小时表达水平下降;Sly转录水平在感染后第0.5~2小时持续增加,与溶血现象呈正相关;GAPDH和FBPS在感染过程中变化不显著(P0.05)。结果表明,SS2感染早期可对RBC产生黏附和溶血作用,先为黏附作用,后为溶血作用,且作用过程较快;主要参与黏附因子为MRP和CPS2J,溶血因子为Sly;GAPDH和FBPS是否参与SS2对RBC的黏附与溶血仍需证实;本试验结果为研究SS2传播和致病机制提供了重要的理论依据。