猪链球菌2型噬菌体裂解酶催化域A5的关键氨基酸位点的鉴定

为了鉴定猪链球菌2型(Streptococcus suis 2)噬菌体裂解酶(Ly ACCG/Ly ACC)催化域A5的关键氨基酸位点,本研究利用NCBI、Pfam和Uniport数据库,对催化域A5的氨基酸序列中的各位点的保守性进行了比对分析;以噬菌体SMP基因组为模板,PCR扩增lyacc基因,测序分析后构建原核表达质粒p SJ2-lyacc;以质粒p SJ2-lyacc为模板,通过PCR扩增的方法将催化域A5中3个高度保守的氨基酸位点(30位的天冬氨酸/D30、53位的苏氨酸/T53和95位的甘氨酸/G95)的密码子分别定点突变为丙氨酸(A)的密码子,经测序确证后将突变体质粒p SJ2-lyacc/D30A、p SJ2-lyacc/T53A和p SJ2-lyacc/G95A分别转化BL21(DE3)感受态细胞,同时将质粒p SJ2-lyacc作为对照平行转化,用IPTG于27℃诱导表达,菌体重悬后超声裂解,上清液过滤,获得的蛋白粗提液经SDS-PAGE分析,表明重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的分子质量均约为30 ku;将重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的蛋白粗提液用于平板裂解试验,结果显示,原核表达的重组Ly ACC的裂菌圈直径为2.2 cm;突变体G95A的裂菌圈直径仅为1.4 cm,裂菌活性部分降低;突变体D30A和T53A的裂菌圈消失,彻底失去裂菌活性。上述结果表明,D30和T53是Ly ACC的关键氨基酸位点。     

MHC B-L基因多态性与鸡白痢沙门氏菌易感性的关联分析

为研究MHC B-L基因的多态性与鸡白痢沙门氏菌感染之间的关系,采用PCR产物直接测序技术对供试鸡MHC B-L基因外显子2进行单核苷酸多态性检测,分别利用Plink1.07软件和PHASE V2.1软件进行病例-对照关联分析和单倍型分析。结果发现,在270bp的序列内共检测到42个单核苷酸多态性位点(SNPs)。C.280C>A位点等位基因在病例-对照样本中的分布存在显著差异(P<0.05);C.246G>T、C.249A>G位点基因型在病例-对照样本中的分布存在显著差异(P<0.05)。C.229T>A和C.249A>G位点组成的单倍型与抗鸡白痢性状差异不显著(P>0.05);同时C.285G>A、C.287A>T和C.288C>A位点组成的单倍型与抗鸡白痢性状的差异也不显著(P>0.05)。结果表明,MHC B-L基因外显子2多态性与抗鸡白痢性状显著相关,为开展沙门氏菌抗性分子标记辅助选择研究提供了一定的依据。     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒3型的双重荧光PCR方法的建立及应用

为建立同时检测牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛副流感病毒3型（BPIV3）的方法,通过对引物和探针筛选、反应体系和条件优化,成功建立了检测IBRV和BPIV3的双重荧光定量PCR方法。该方法只能特异性地检出IBRV和BPIV3,而对其他无关病原均不能检出;批内和批间变异系数均小于3%;对IBRV和BPIV3质粒标准品的检测下限分别为15.2 copies/μL和18.3 copies/μL。用建立的方法对采自四川、重庆、河北、安徽和吉林这5个地区的143份肉牛呼吸道疾病综合征(BRDC)样本以及四川省和青海省的59份牦牛BRDC样本进行检测,结果显示,肉牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为42.66%和39.86%,混感率为22.38%;牦牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为44.07%和30.51%,混感率为18.64%。上述结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有特异性和稳定性好、灵敏度高的特点,适用于临床上对IBRV和BPIV3的快速检测,临床样本的检测结果丰富了国内IBRV和BPIV3的流行病学资料。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

斑点印迹杂交技术测定牛疱疹病毒核酸序列

在斑点印迹、核酸杂交的基础上,R.H.Andin。等利用~(32)P标记、切口平移和质粒探针的方法建立了一种检测牛疱疹病毒1型阿根廷分离株的敏感和特异的方法。该探针包含病毒基因组左侧的克隆Bam H1限制性片段。该方法检测灵敏度为10pg病毒DNA。     

牛副流感病毒3型TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群临床样本进行了检测。结果显示,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的最低检测限为17.6copies/μL,同时进行批内、批间5次重复性试验,变异系数均小于2.5%。应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒1型,结果均为阴性,说明建立的方法特异性较强。用建立的方法检测人工感染BPIV3的犊牛鼻拭子样本,检测结果与样本TCID50的测定结果相符合,但比其更敏感。结果表明,本试验中建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR可以作为BPIV3早期诊断及定量分析的有效技术手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒LA株DNA的分子克隆

本实验用鸟枪法和选择法将牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的LA株DNA克隆到载体质粒pBR325,pBR322或pUC_9的HindⅢ位点中。经用光生物素标记的IBR DNA和牛胸腺细胞DNA与各重组质粒杂交筛选后,共得到10个病毒DNA的HindⅢ片段,分别是A,B,C,E,G,I,J,K,L和M,克隆的DNA占全病毒DNA的89.5％。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和日本脑炎病毒二联基因芯片的构建与应用

针对靶基因库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组质粒T/PRRS-PS9、T/Y11和日本脑炎病毒(JEV)的重组质粒T/PRM/M、T/JEV-C,设计4对特异性引物,采用PCR扩增获得4个靶基因片段,并用PCR标记Cy3探针,建立了一种检测PRRSV和JEV的芯片方法。特异性试验结果显示,PRRSV、JEV之间无交叉杂交,猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒与PRRSV-JEV基因芯片无杂交反应。灵敏性试验结果显示,50μL杂交体系中探针DNA的质量浓度为0.295pg/μL时仍为杂交阳性。对从猪场收集的31份样品进行处理并用基因芯片检测,PRRSV的检出率为12.9%(4/31),JEV的检出率为9.68%(3/31),PRRSV与JEV混合感染的检出率为0(0/31)。此方法的结果与PCR的检测结果完全符合。结果表明,所建立的二联基因芯片有望成为一种快速鉴别PRRSV与JEV的新方法。     

猫源蓝氏贾第虫HRM快速基因分型方法的建立

为建立一种蓝氏贾第虫的快速基因分型方法,选取β-贾第素(β-giardin)基因作为遗传标志,采用HRM技术对华南地区常见的猫源蓝氏贾第虫A型、F型进行基因分型。根据GenBank中登录的序列KJ027416.1(A型)和JX 275388(F型)设计了qPCR-HRM引物BGF和BGR,通过对反应温度和反应体系进行优化,建立了HRM基因分型方法,并对其稳定性、敏感性和准确性进行了检测。结果显示,HRM分型方法可对蓝氏贾第虫A型、F型以及混合感染情况进行检测;批内和批间重复性均良好;当样品质量浓度低至4.27×10-4 ng/μL时,HRM检测方法依然可以分辨出基因型;其准确性与测序结果完全一致。结果表明,建立的HRM基因分型方法具有快速、稳定、敏感和准确的特点,适用于猫源蓝氏贾第虫的临床检测和贾第虫病的分子流行病学调查。     

牦牛MBL2基因3′-UTR区抗菌相关SNPs的筛选

为了筛选牦牛MBL2基因3′-UTR区与抗菌有关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),本研究通过扩增青藏高原521头牦牛血液中MBL2基因3′-UTR区,并分别进行测序,利用DNAMAN8.0、CHROMAS 2.6.6和Haploview软件对序列进行SNPs预测和连锁不平衡分析,使用ELISA检测试剂盒分别检测血清中多杀巴氏杆菌和布氏杆菌抗体D_(450)值,利用SPSS分析SNPs与多杀性巴氏杆菌和布氏杆菌血清抗体D_(450)值的相关性,并通过miRWalk和RNA 22数据库对靶向牦牛MBL2基因3′-UTR区的miRNAs进行预测筛选。结果显示,牦牛MBL2基因3′-UTR区SNP大小为861 bp,预测存在A997C、T1295C、A1473T、C1511T和C1540T共5个SNPs,其中A997C和T1295C、A1473T和C1540T位点强连锁不平衡,A997C/T1295C位点CC/CC基因型与多杀性巴氏杆菌抗体D_(450)值的相关性显著高于AA/TT基因型和AC/TC基因型(P0.05);共预测到223个靶向牦牛MBL2基因3′-UTR区的miRNAs,其中12个miRNAs分别靶向T1295C、A1473T、C1511T和C1540T位点。结论,牦牛MBL2基因3′-UTR区A997C/T1295C位点多态性可能与牦牛抗多杀性巴氏杆菌性状具有相关性,12个miRNAs可能通过靶向T1295C、A1473T、C1511T和C1540T位点参与牦牛MBL表达水平调节。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立

根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;对保存的50份PPD检测阳性牛的鼻黏液、牛乳和淋巴结进行检测,结果6份结核分枝杆菌阳性,1份牛分枝杆菌阳性,其余均为阴性,与PCR的检测结果一致。由此可见,建立的二重实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。     

牛冠状病毒牛肠病毒牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测牛冠状病毒（BCoV）、牛肠病毒（BEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光PCR方法并应用于临床检测,根据BCoV N基因、BEV 5′-UTR基因、BVDV 5′-UTR基因设计3对特异性引物和探针,通过对引物、探针的浓度以及反应条件的优化,建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法,并对该三重PCR方法的敏感性、重复性、特异性和临床样本检测结果进行了评价。结果显示,该方法灵敏度高,对BCoV、BEV和BVDV的最低检测限为10 copies/μL;重复性稳定,批内和批间变异系数（CV）均在2%以下;特异性强,对常见腹泻类病原无交叉反应。应用此方法检测河南省445份牛腹泻粪便样本,BCoV、BEV和BVDV的阳性率分别为6.5%(29/445)、17.5%(78/445)、12.1%(54/445)。上述结果表明,本研究建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒一步法三重实时荧光PCR方法,为疫病的快速检测及预防提供了有效的技术手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定

为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。     

牛白血病病毒前病毒DNA荧光PCR检测方法的建立及应用

为快速检测牛外周血淋巴细胞中的牛白血病病毒(bovine leukem ia vir,uBsLV)前病毒DNA,选取BLVenv基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立检测牛白血病前病毒DNA的荧光PCR方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价及实际样本的验证检测。结果显示,该方法具有很高的特异性和重复性,最低检出限为每个反应可检出3个拷贝数的阳性标准质粒对照。在175头BLV抗体阳性牛中,用该方法共检出127头BLV感染牛。在262头BLV抗体阴性牛中,用该方法检出2头BLV感染牛,该方法与套式PCR之间检测结果的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的方法可用于BLV感染牛的确证。     

A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

本研究旨在建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的恒温隔绝式PCR(iiPCR)。采用靶向PEDV S基因的引物和探针,通过对引物、探针、Taq酶及反转录酶等进行优化,建立了检测PEDV的iiPCR,对其特异性、敏感性和稳定性进行评价,对15份PEDV阳性样本和7份阴性样本进行检测,比较与现有的荧光定量RT-PCR方法的符合率,并对115份仔猪腹泻样本进行检测。结果显示,iiPCR的最佳反应体系为:上、下游引物各3.5μL、探针0.25μL、Taq酶1μL、反转录酶1.25μL、Buffer A 25μL、模板2μL,补足DEPC水至50L,从样本处理到报告结果仅需1 h;该方法能检出样本中的PEDV,对TGEV、PPV、CSFV等无关病原不检出,检测下限为17.5 copiesμL,对5个稀释度的阳性标准品进行检测,3次重复结果一致,与现有荧光定量RT-PCR的总符合率为90.9%;本研究建立的iiPCR对仔猪腹泻样本中PEDV的检出率为22.6%(26/115)。综上可见,本研究成功建立了检测PEDV的iiPCR,为PED的诊断提供了更为便捷并可现场使用的可靠方法。     

通用型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是牛的主要病原之一,对全球养牛业造成了巨大的经济损失。本文根据GenBank中BVDV基因组中5′-UTR序列合成引物,建立了同时检测BVDV两个基因型的RT-PCR方法。结果显示,所建方法具有较强特异性和敏感性,可扩增出长约300 bp的特异性片段,最低检测限量为6.8×10~3copies/μL。用该方法对30份临床样品进行病原检测,结果显示,BVDV阳性样品4份,阳性率为13.33%。对阳性PCR产物测序及序列分析的结果表明,该牛病毒性腹泻病毒流行株属于BVDV-2型。3份阳性样品SD3、NM26、NM29与国内流行株新疆XJ-04亲源关系最近,相似度达96.9%。本研究建立的通用型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,可用于临床上牛病毒性腹泻病毒的检测。     

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10~2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。     

二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立

为绝对定量检测禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）和鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）,本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针,通过优化引物和探针的浓度及反应条件后,建立了二重ddPCR定量检测ARV和MS方法,并对建立方法的特异性、敏感性和重复性进行测试。结果显示,优化后最佳的引物和探针浓度分别为1.2和0.35μmol/L,最佳退火温度为55℃。特异性检测结果只检出ARV和MS,没有检出其他对照的禽病病原。敏感性检测结果显示,该方法检测ARV及MS重组质粒DNA的检出限分别为微滴数6.3和5.4 copies/μL,检测方法的检出限与单重ddPCR最低检出限相同,敏感性比荧光定量PCR方法高10倍。对3个连续稀释的ARV和MS重组质粒DNA检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对92份病鸡关节囊、喉拭子及肺样品进行检测,二重ddPCR方法检出12份样品呈ARV阳性,9份样品呈MS阳性,其中2份样品呈ARV和MS阳性,A...