山羊支原体山羊肺炎亚种黏附相关蛋白的特性

为鉴定山羊支原体山羊肺炎亚种的黏附相关蛋白,通过对山羊支原体山羊肺炎亚种基因组编码的假定的膜蛋白基因(0297)进行扩增,并连接到pET-32a(+)载体,转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,大小约为43ku,将该重组蛋白命名为P0297。用纯化的P0297免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。利用激光共聚焦显微镜观察到蓝色的细胞核周围有重组蛋白的绿色荧光存在,其外形与细胞膜的红色荧光基本重合,表明P0297对山羊气管上皮细胞有明显的黏附作用。夹心ELISA结果显示,重组蛋白P0297的黏附作用与蛋白浓度成正比,并且黏附作用可被多克隆抗体阻断,说明该重组蛋白的黏附为特异性黏附。上述结果表明,P0297蛋白是山羊支原体山羊肺炎亚种的一个黏附相关蛋白。     

猪肺炎支原体选择分离培养的研究

从猪流行性肺炎野外病例分离猪肺炎支原体(M. suipneumoniae)历来是非常困难的。其原因是由于肺炎病灶部存在很多猪鼻支原体(M. hyorhinis),而在人工培养基上它通常比肺炎支原体(M.pneumoniae)生长的旺盛。我们为了探讨肺炎支原体(M. pneumoniae)的选择分离培养方法,使用下述培养基和培养方法取得了良好的结果。     

猪气喘病病原体——猪肺炎支原体的分离和培养研究

猪气喘病,据报道(华南农科所,1959)从1953年开始即引起广州地区的兽医工作者的重视。最初,他们诊断为小猪地方流行性支气管肺炎;后经深入研究,认为其特性与英国学者Betts等报道的猪病毒性肺炎的特征,大致相同。随着养猪事业的大发展,猪数急增,调动频繁,集体饲养多,猪与猪接触机会也多,再则猪的几种烈性传染病和猪瘟等已基本上获得控制;这种慢性呼吸道病才显得格外突出,流行也较广泛。经全国各地研究,全国猪气喘     

猪肺炎支原体抗原定量ELISA检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体抗原的快速检测方法,本研究以抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体为包被抗体,抗P46蛋白多克隆抗体为检测抗体,建立了猪肺炎支原体双抗体夹心ELISA方法。通过优化后的反应条件为:抗猪肺炎支原体P46蛋白单克隆抗体包被浓度为2.5μg/mL,抗P46蛋白多抗及酶标二抗稀释度分别为1∶40 000和1∶10 000。该ELISA的重复性变异系数小于10%,最低检出量为9.754 ng/mL,与猪鼻支原体、猪滑液支原体、絮状支原体等无交叉反应。使用该ELISA方法对人工稀释的培养物中抗原含量进行检测,通过单点法和对样品倍比稀释后进行双平行线拟合两种方法计算,得出两种计算方法结果均与真实值基本相符,但双平行线法检测比单点法检测更加稳定。本研究建立的双抗体夹心ELISA方法为猪肺炎支原体的定量检测提供了有效手段,可用于猪支原体肺炎灭活疫苗生产过程中抗原的检测,为灭活疫苗生产中的质量控制提供了便利。     

猪肺炎支原体PCR快速检测方法的应用研究

为对猪场中猪肺炎支原体的感染和发病情况进行有效地病原学监测,本研究筛选国内外最常用且引用率最高的靶向16S rRNA基因的引物对作为检测猪肺炎支原体的特异性引物,通过制定临床猪肺组织样品、鼻拭子样品和肺泡灌洗液样品的标准化采集与处理方法,比较菌液样品、肺组织样品、鼻拭子样品与支气管肺泡灌洗液等不同样品的不同DNA提取方法,验证PCR检测方法适用的临床样本范围。结果表明,对于菌液样品和鼻拭子样品可选用经济快速的水煮法,对于肺组织样品和肺泡灌洗液样品使用高效的试剂盒提取法。本研究表明,使用靶向16S rRNA基因的引物对进行PCR检测,可满足临床上对猪肺炎支原体快速检测的要求。     

广东省瘦肉型种猪场猪萎缩性鼻炎痢疾支原体肺炎的调查

应用病原分离、直接涂片镜检和间接血凝试验法对广东省26个瘦肉型种猪场的4086头种猪分别进行猪传染性萎缩性鼻炎(AR)、痢疾(SD)和支原体肺炎(MPS)的调查,结果AR、SD、MPS的阳性率分别为:1.05％、1.64％和70.04％,AR、SD各有18个场检出带菌猪,MRS检25个场全部为阳性场。这表明,广东省种猪场普遍感染AR、SD和MPS,而MPS感染最为严重,但上述三种疫病在种猪群中极少表现明显临床症状,呈一种隐性带菌状态。检验结果还说明,AR、SD和MPS感染率的高低与猪场的兽医卫生管理水平、猪群密度及通风条件有关。     

磷酸替米考星对人工感染猪支原体肺炎的治疗试验

为了评价磷酸替米考星可溶性粉(10g/0.1kg)对人工感染猪支原体肺炎的治疗效果,建立了人工感染猪支原体肺炎模型,通过检测受试猪的死亡率、治愈率、有效率、增重效果、感染仔猪的支原体肺炎肺部病变评分等指标,评估了不同剂量磷酸替米考星可溶性粉对人工感染猪支原体肺炎患猪的治疗效果。结果显示,尽管高剂量的磷酸替米考星可溶性粉显示出明显的治疗猪支原体肺炎的效果,但按60～80mg/L的剂量通过饮水口服途径即已显示出了明显的治疗效果,并且使用60～80mg/L磷酸替米考星可溶性粉治疗猪支原体肺炎的效果与目前市售的替米考星可溶性粉(10g/0.1kg,75mg/L水,以替米考星计)的效果相当。结果表明60～80mg/L磷酸替米考星可溶性粉可作为治疗猪支原体肺炎的最佳使用剂量。而磷酸替米考星与替米考星相比,由于增加了磷酸基团而显著增加了其水溶性,以致磷酸替米考星可溶性粉在将来的临床使用中将更加便捷。     

猪肺炎支原体P97基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

采用PCR扩增了猪肺炎支原体(Mhp)R659株黏附因子P97基因,测定了其核苷酸序列,并将其克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上。在脂质体介导下将PacⅠ酶线性化的重组穿梭质粒pacAd-P97和腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染AD-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-P97,用RT-PCR、Westernblot和间接免疫荧光试验检测重组P97蛋白在AD-293和PK15细胞中的表达。之后,用Ad-P97抗血清检测Mhp对宿主细胞的黏附作用以及Ad-P97在仔猪体内的免疫应答反应。结果显示,P97基因由3 339个核苷酸组成,共编码1 113个氨基酸,其核苷酸序列高度保守;重组P97蛋白可在Ad-P97感染的AD-293细胞和PK15细胞中高效表达,但Ad-P97不能在PK15细胞中增殖并引起细胞病变;Ad-P97具有良好的免疫原性,能抑制Mhp对PK15细胞的黏附作用,诱导免疫仔猪产生Mhp凝集抗体。上述结果为进一步研制安全、高效的Mhp重组疫苗奠定了基础。     

猪植原体肺炎

猪植原体肺炎(Mycoplasmal Pneumonia)是猪的一种传染性慢性肺炎,发病率很高,广泛存在于全世界各地。澳、英、瑞典、芬、加、美国等国的研究者均曾以不同的病名报告过这种慢性肺炎的发生,如,“猪病毒性肺炎”,“猪地方流行性肺炎”等。本病引起的主要损失在于猪只生长缓慢和饲料消耗增加,据有人调查,病猪的肥育期较健康猪约延长一个月,饲料消耗增加10％。由此造成的经济损失,在英国估计为每年1,500万英镑,美国约为12,000万美元。     

牛支原体肺炎PCR诊断方法的建立及初步应用

参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列,设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R,建立了牛支原体PCR检测方法,并在扩增条件优化的基础上,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,进而应用建立的方法完成了疑似牛支原体肺炎临床病料的检测。结果显示,建立的PCR方法对牛支原体的核酸样品能扩增出534 bp的特异性目的片段,而对无乳支原体、丝状支原体、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、黏质沙雷氏菌、变形杆菌等牛常见条件病原微生物核酸样品均未见明显的扩增条带,且其可检测出的牛支原体DNA最低浓度约为0.000 002 875μg/mL。对临床样品的检测结果显示,该方法的检出率与与病原分离的符合率为100%。上述结果表明,本研究成功建立了牛支原体PCR检测方法,可用于临床上牛支原体肺炎的快速诊断。     

猪肺炎支原体P97 C末端蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析

以大肠杆菌表达的pET-30a-P97C重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备针对猪肺炎支原体P97C末端蛋白的单克隆抗体,并将其与截短表达的P97C末端蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定了P97C末端蛋白的抗原表位。进一步采用肽探针扫描技术确定最小抗原决定区域,并通过生长抑制试验及抗黏附特性试验对抗原表位进行了分析。结果显示,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株A3C9和B4D5,并成功鉴定出P97C末端蛋白的2个独立线性表位F905PMAFSY911和G991TPNQGKKAE1000。2株单抗对猪肺炎支原体的生长均有一定的抑制作用,但对其黏附特性没有显著抑制作用。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及其生物学特性的研究

为了对疑似猪接触传染性胸膜肺炎的病死猪肺脏进行胸膜肺炎放线杆菌(APP)的分离鉴定,并研究其生物学特性,通过形态学及培养特性观察、生化试验、PCR方法对分离菌株进行了鉴定,并对APP分离株进行了NAD依赖试验生物学分型、PCR方法血清学分型、PFGE基因分型以及K-B纸片法药敏试验。结果显示,共分离到16株APP,源自两省三地的APP分离株具有一致的形态学特征和相似的生化特性。9株福建分离菌均为生物Ⅱ型,其PFGE基因型均为Pa4;7株安徽分离菌均为生物I型,其中6株为血清型12型,菌株FD1402的PFGE基因型为Pa2,其余5株APP菌株的PFGE基因型为Pa1,剩余1株为血清型3型,其PFGE基因型为Pa3。药敏试验结果显示,对18种常用抗菌药中的环丙沙星、诺氟沙星、氟苯尼考,安徽株均100%敏感,福建株依次为88.9%、77.8%和66.7%敏感;所有分离株对其他15种药物均表现出不同程度的耐药。上述结果表明,不同来源APP菌株的生物学特性较为一致。血清型12型是安徽省APP的主要流行血清型之一。APP分离株的PFGE基因型与血清型、生物型之间无明显的相关性。     

支原体及支原体病

支原体这类微生物已被发现将近一个世纪。但它的发展道路是坎坷的,以致长期未能还其本来面目。在微生物发展史上,支原体曾被误认为是病毒或细菌。这就阻碍了支原体研究的发展。     

猪霉形体肺炎的诊治

20 0 1年 7月 ,安徽省含山县某猪场暴发以喘气为特征的呼吸道传染病 ,发病率达 10 0 % ,致死率 3 3 %。根据临床症状、剖检变化及实验室检验 ,确诊为猪霉形体肺炎。1　发病情况该猪场曾于 2 0 0 1年 5月上旬先后 2次购进育肥猪 12 5头 ,2 0 0 1年 6月上旬接种猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联疫苗。 2 0 0 1年7月中旬其中一圈的 10头育肥猪出现咳嗽症状 ,继而整个猪舍的育肥猪全部发病。2　临床症状病猪食欲不振 ,日渐消瘦 ,体温升至 40℃。呼吸增快 ,呈腹式呼吸 ,有的张口呼吸。随着病情逐渐加重 ,出现痉挛性咳嗽 ,口、鼻流黏性和脓性鼻液 ,死亡猪…     

猪传染性胸膜肺炎的诊断

１９９８年在湖南省娄底、益阳、长沙等地的部分猪场先后发生疑似猪传染性胸膜肺炎。此病在湖南省尚未见报道,笔者对长沙某外贸出口猪场发病猪群进行了系统诊断。１　发病情况该猪场有母猪２４０余头,仔猪１０００余头,生长肥育猪７００余头。４月１５～１６日开始发病,先后有１０余头母猪、１００余头仔猪、２０余头生长发育猪发病,总发病率在８％左右,总病死率达７２％。２　临床症状急性病例多突然死亡,有些表现体温升高（４１℃左右）,呼吸急促,犬坐式呼吸,治疗不及时常于２ｄ内窒息死亡。慢性病例体温稍有升高,咳嗽,腹式呼…     

猪传染性胸膜肺炎的诊治

猪传染性胸膜肺炎的诊治马立功（山东省文登市米山兽医站２６４４２４）于诗鹏（文登市文城镇兽医站）孙广彦刘家玉杨相毕（文登市畜牧中心猪传染性胸膜肺炎，亦称猪嗜血杆菌胸膜肺炎，是猪的一种高度致死性传染病，尤其在规模养猪场多见。１９９５年春天，我市某猪场曾发...     

绵羊肺炎支原体免疫蛋白质组学的初步研究

利用双向电泳及免疫印迹方法对绵羊肺炎支原体MoGH3-3分离株的抗原蛋白进行筛选,并采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱对其进行初步鉴定。结果,共筛选到MoGH3-3株3个主要抗原蛋白点,其中2个被鉴定为延伸因子(elongation factor Tu,EF-Tu),1个为丙酮酸脱氢酶E1-a亚单位(pyruvate dehydrogenase E1-alpha subunit,PDHA)。结果表明,EF-Tu及PDHA是绵羊肺炎支原体主要的抗原蛋白,这为下一步绵羊支原体肺炎基因工程疫苗的研制提供了靶标。     

绵羊肺炎支原体P108蛋白的分子特征分析及免疫原性研究

为进一步探究绵羊肺炎支原体P108蛋白的结构及其免疫原性,在进行生物信息学分析的基础上,对编码P108的部分基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blot方法对其免疫原性进行了分析。结果显示,p108基因与猪肺炎支原体黏附相关基因mhp385的核苷酸同源性较高,扩增的p108部分基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在;重组蛋白可以与山羊抗绵羊肺炎支原体血清发生结合反应,表明P108蛋白是免疫原之一。本研究结果表明P108蛋白可以诱导机体产生免疫应答,是建立绵羊肺炎支原体感染血清学诊断技术的潜在抗原。     

绵羊肺炎支原体免疫组织化学及间接免疫荧光检测方法的建立

以病理组织学观察为基础,建立检测绵羊肺炎支原体的间接免疫组织化学和间接免疫荧光方法,以绵羊肺炎支原体标准血清为一抗,分别以家兔抗山羊Ig G-HRP和家兔抗山羊Ig G-FITC为二抗,对绵羊肺炎支原体阳性肺组织切片及阴性对照组切片进行HE染色、免疫组织化学染色及间接免疫荧光染色,并优化染色条件,以确保组织切片在最佳的条件下进行鉴定。结果显示,本试验所建立的免疫组织化学方法与PCR方法对病样的检出率相符,且高于传统的分离培养法。结果表明,本试验建立的间接免疫组织化学方法和间接免疫荧光方法可用于对临床病例的组织样本检测,具有很强的特异性和可靠性,可直观地观察和探究该病原在机体内的定位、动态分布以及致病机理,以期为临床诊断提供更可靠的方法。