马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达

为了解马麝朊蛋白基因的结构特征和其细胞型朊蛋白的性质,应用分子克隆和DNA重组技术进行了马麝朊蛋白基因的克隆、序列分析及其原核表达.序列分析表明,马麝朊蛋白基因编码区是包含在单一外显子内的完整开放阅读框,全长为771 bp,与马鹿、白尾鹿以及乳牛和绵羊朊蛋白基因相比,核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为97.3%～98.1%和97.7%～98.8%,说明朊蛋白基因在同科和不同科的反刍动物间是保守的;成功构建了马麝重组朊蛋白(85～233 aa)原核表达栽体pGEX-MuPrP(85～233),并转化E.coli BL21(DE3),获得重组表达菌E.coli GST-MuPrP(85～233),该重组菌可产生预期大小约为42.4ku的融合蛋白GST-MuPrP(85～233),在优化表达条件下,可产生占细菌总蛋白量30%以上的融合蛋白,免疫印迹检测显示表达蛋白可与抗牛单克隆抗体4C11反应,表明该基因的各氨基酸突变并未影响其单抗4C11的识别表位.     

山羊支原体山羊肺炎亚种M17基因的原核表达及细胞定位研究

为分析山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)氨基肽酶M17的特征及细胞定位。参照GenBank中Mccp M1601株的M17基因序列,优化密码子,合成原核表达载体pET30a-M17,将鉴定正确的表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导后获得融合表达蛋白;用其免疫新西兰兔,制备超免疫血清,并测定其效价和代谢抑制效果;通过Western-blot和i ELISA两种方法对M17在Mccp细胞内的分布进行了初步研究。结果显示,pET30a-M17重组蛋白在大肠杆菌中获得成功表达,大小约50 ku,与预期相符,密码子优化后的表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在;免疫后的兔血清抗体效价达1∶80 000以上,说明M17重组蛋白具有较好的免疫原性和反应活性;M17多抗血清对Mccp无代谢抑制作用,但能够与Mccp的膜蛋白、胞浆蛋白及全菌蛋白发生特异性反应,表明M17蛋白在Mccp的细胞膜和细胞质中均有分布,但细胞膜中含量略高于细胞浆。M17的成功表达以及在Mccp中的细胞定位为其生物学功能研究奠定了基础,也为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制提供了参考。     

多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1基因的克隆及原核表达

为研究多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1的功能,利用PCR分别以多头带绦虫基因组DNA和cDNA为模板扩增TmAdh1的基因组序列和cDNA序列,并利用生物信息学软件对该基因进行预测分析。将TmAdh1基因片段连接至原核表达载体pGEX4T-1进行原核表达,并利用Western-blot分析该蛋白的抗原性。结果显示,TmAdh1的基因组序列长1 848bp,由2个内含子和3个外显子组成,其开放阅读框的长度为402bp,编码133个氨基酸残基。预测分析表明,TmAdh1蛋白含有1个N端信号肽序列、1个纤连蛋白三型(FnⅢ)结构域、1个糖基化位点和8个线性B细胞抗原表位。在原核系统成功表达了约40ku的重组蛋白TmAdh1,用其免疫小鼠制备超免疫血清。Western-blot试验表明,重组蛋白TmAdh1可以与免疫小鼠血清反应。以上研究结果表明,多头带绦虫TmAdh1基因是带科绦虫宿主保护性抗原的同源基因,可作为脑多头蚴病疫苗的候选分子。     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。     

弓形虫硫氧还蛋白样蛋白基因的克隆与原核表达

为掌握刚地弓形虫硫氧还蛋白样蛋白(thioredoxin-like,TRXL)的生物学特性及其作为诊断候选分子的潜力,针对trxl基因序列设计引物,通过RT-PCR法扩增弓形虫trxl基因,并将其连接至pET-30a(+)原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,分析了rTRXL蛋白的反应原性。结果显示,弓形虫trxl基因全长1 275bp,共编码424个氨基酸,与GenBank中下载的弓形虫ME49株trxl基因的参考序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,诱导表达的重组蛋白rTRXL的大小约48ku,与预期的结果相符,主要以包涵体形式存在。Western-blot结果显示,重组蛋白rTRXL能被感染弓形虫的猪阳性血清识别,表明重组蛋白rTRXL具有良好的反应原性。上述研究结果为弓形虫rTRXL蛋白作为新型弓形虫诊断试剂候选抗原的研究奠定了基础。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)表面蛋白(surface protein,SU protein)和抗SU蛋白的多克隆抗体,根据Gen Bank已登录的ENTV Shaanxi株SU基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增SU基因并将其连接于原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-28a-SU,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为43 ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化、复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western-blot分析结果表明,原核表达纯化的SU蛋白能够与制得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗体特异性结合。上述结果表明,本试验成功获得了纯化的ENTV SU蛋白和小鼠抗ENTV SU蛋白的多克隆抗体,为进一步研究SU蛋白在ENTV感染过程中的作用和建立诊断方法提供了材料。     

大片吸虫Ras家族蛋白基因的克隆表达及免疫反应性研究

Ras家族相关蛋白是多种信号转导途径的关键组成蛋白,在寄生虫的生长发育过程中发挥着重要作用,但大片吸虫的Ras家族蛋白基因(Fg Rap1)尚未见报道。本研究旨在对Fg Rap1进行克隆、表达、序列分析及免疫反应性评价。根据肝片吸虫的基因组及转录组数据,设计肝片吸虫Ras家族蛋白基因引物,以大片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR获得Fg Rap1基因;对其进行生物信息学分析及鉴定;然后构建p ET-SUMO-Fg Rap1重组表达载体,在大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;对纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明,大片吸虫Fg Rap1基因大小为648 bp,编码215个氨基酸残基。生物信息学分析表明,该蛋白含有9个亲水区,但无跨膜区,有6个α螺旋、8个β折叠、2个较长的β转角、1个较长的无规则卷曲和8个主要的线性B细胞抗原表位。Fg Rap1蛋白为包涵体表达,用大片吸虫排泄分泌抗原免疫家兔的阳性血清进行Western-blot分析,表明其具有良好的免疫反应性。本研究首次克隆并鉴定了大片吸虫Ras家族蛋白基因,表达的重组蛋白具有良好的免疫反应性,该蛋白是潜在的大片吸虫诊断候选抗原。     

牛型布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因的克隆与原核表达

采用PCR技术从河北省某牛场流产污物中扩增得到布鲁氏菌外膜蛋白(OMP31)基因,将其连接入pMD18-T克隆质粒并进行序列测定;测序正确后,将该基因插入pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌Rossetta(DE3)感受态细胞,诱导表达融合蛋白,并用Western-blot分析表达蛋白的免疫反应特性。结果显示,扩增了OMP31的全基因,基因全长723bp,共编码241个氨基酸。成功构建了布鲁氏菌OMP31基因的原核表达载体pET-OMP31,并且在大肠杆菌中表达了OMP31蛋白,经Western-blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应。证实布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因已成功表达,为布鲁氏菌病血清学诊断方法的建立及亚单位疫苗的研究提供了基础资料。     

马尔他布氏杆菌LpxK基因的克隆及原核表达

为了克隆马尔他布氏杆菌LpxK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中马尔他布氏杆菌M5-90株LpxK基因序列信息设计引物,从M5-90株基因组扩增出1 026bp的目的基因;然后将其连接入pMD20-T载体,转化入大肠杆菌DH5α并测序;测序正确后将目的基因连接入pET-28a(+)质粒,构建重组质粒pET-28a(+)-LpxK,并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a(+)-LpxK原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了LpxK基因,表达的融合蛋白大小约41ku且主要以包涵体形式存在。     

肠炎沙门菌效应蛋白AvrA的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)avr A基因功能及其在感染过程中的表达分布情况,本研究通过PCR技术克隆获得了avr A基因,并构建了肠炎沙门菌Avr A原核表达载体p Cold-avr A,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;表达蛋白经纯化后免疫小鼠获得Avr A多克隆抗体,通过Western-blot检测了抗体特异性。结果显示,成功构建了表达载体p Cold-avr A,并获得了纯化的Avr A蛋白,成功制备了小鼠抗Avr A蛋白的多克隆抗体,可用于检测细菌Avr A蛋白的表达。本研究成功获得纯化的Avr A蛋白及其多克隆抗体,为进一步探讨Avr A在肠炎沙门菌感染过程中所发挥功能奠定了基础。     

马尔他布氏杆菌KdtA基因的克隆及原核表达

为了研究马尔他布氏杆菌KdtA蛋白的功能,根据GenBank中公布的马尔他布氏杆菌M5-90株KdtA基因序列,利用DNAMAN软件设计上、下游引物,以M5-90株的基因组DNA为模板,采用PCR对其进行扩增,凝胶回收纯化后得到1 341bp的目的片段;然后构建克隆重组质粒pMD20-T-KdtA,将其转化到大肠杆菌DH5α;待测序正确后,构建原核表达质粒pET-28a(+)-KdtA,再将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,用SDS-PAGE和Western-blot对基因的表达情况进行分析检测。结果表明,成功克隆了KdtA基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了KdtA基因;经诱导后得到了预期的目的蛋白,证明KdtA基因得到了成功表达。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表达

构建了TGEV TH-98株M基因序列的原核表达载体,利用RT-PCR方法从TGEVTH-98株中扩增出M蛋白基因,并亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白。结果表明,从TGE TH-98株克隆到了M基因cDNA,该基因全长789 bp,与T014株、Purdue株、TFI株和96-1933株的M基因同源性分别为92.37%、98.35%、99.87%和96.96%。SDS-PAGE电泳结果显示,重组表达质粒获得了约57 ku的目的带,其中M蛋白的分子质量约为31 ku,与预期的结果一致;Western-blotting分析表明,融合表达产物可与TGEV全病毒制备的阳性血清发生反应。证实,TGEV的M基因高度保守,构建的M基因原核表达载体pGEX-6P-TM能在大肠埃希氏菌中获得高效表达。     

金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A基因的克隆及其原核表达

根据GenBank中纤连蛋白结合蛋白A基因(fnbA)序列设计了1对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增;结果获得了3 600bp的DNA片段。将PCR产物克隆至pGEM T easy载体中,成功地构建了克隆质粒pGEM-fnbA。以HindⅢ和XhoⅠ双酶切pGEM-fnbA和pET28a( ),将纯化的基因fnbA亚克隆至pET28a( )中,构建了原核表达质粒pET28a-fnbA,并将其转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,在约165 ku处出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带。Western-blotting分析表明,该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。     

弓形虫RH株热应激蛋白40基因的克隆与原核表达

为研究弓形虫热应激蛋白40(TgHSP40)的生物学特性,采用RT-PCR方法从弓形虫RH株中扩增出TgHSP40基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)后转化入表达菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,应用Western-blot对重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,重组菌可表达出分子质量约46ku的重组融合蛋白,在37℃、IPTG浓度为1.0mmol/L、诱导6h的情况下表达效果最好。重组蛋白经纯化后进行的Western-blot分析证实,表达、纯化的弓形虫RH株HSP40蛋白具有良好的反应原性,与弓形虫基因Ⅰ型的RH株、基因Ⅱ型的PRU株以及基因型为ToxoDB9的TgC7株和GJS株的阳性血清均可发生特异性反应,预期可作为弓形虫病ELISA诊断方法的候选抗原。本研究结果为弓形虫病新型诊断方法的建立奠定了基础。     

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸.对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEx-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5a后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物.结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白.对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性.     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPc)基因。测序分析表明,所克隆的羊PrPc基因片段大小为771 bp,包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列,其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21(DE3),挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达,收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明,PrP基因在大肠杆菌中成功表达,并能被抗牛PrPc单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%~45%,目的蛋白以包涵体的形式存在,包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

山羊前动力蛋白2基因的克隆及其在OFTu细胞中的表达

为深入研究前动力蛋白2(prokineticin 2,PK2)在山羊炎症性疾病中的作用,本研究克隆了海南黑山羊的PK2基因,并对其基因序列及编码蛋白进行了分析;构建了过表达载体pEGFP-N1-PK2和干扰表达载体pSUPER-PK2,并转染至羊胚胎鼻甲细胞(ovine fetal turbinate,OFTu)中进行表达。结果显示,PK2基因种间同源性低,山羊PK2基因编码的蛋白由109个氨基酸组成,在蛋白序列的第9～25位间存在一个潜在的跨膜区,具有prokineticin结构域,是结构保守蛋白。ELISA检测表明,成功在OFTu细胞中进行了PK2蛋白的过表达和干扰表达。本研究结果为深入研究PK2基因的上下游信号通路及其在山羊疾病中的致炎机制提供了基础数据和工具。     

山羊NLRP3基因的克隆及其在DF-1细胞中的表达

为了解山羊NLRP3基因及其编码蛋白的生物学信息,采用RT-PCR扩增了海南黑山羊NLRP3基因并进行了序列及其编码蛋白的结构分析,构建了pIRES2-EGFP-NLRP3真核表达载体,并将其转染至DF-1细胞中进行了表达。结果表明,NLRP3基因在物种内的同源性高,种间同源性低,编码的蛋白由1 031个氨基酸组成,存在3个潜在跨膜区,分别为第401~419、435~453和884~904位氨基酸,不含信号肽;辣根过氧化物酶单层细胞免疫化学检测证实,构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-NLRP3在DF-1细胞中成功表达。本研究结果为建立NLRP3专性表达细胞系及深入研究NLRP3在山羊抗感染免疫的机制奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌Fc段受体结合蛋白A基因的克隆与原核表达

为研制葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)的相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从金黄色葡萄球菌基因组中扩增出了876bp的细胞壁结合蛋白SPA基因,该基因编码292个氨基酸,包含了E、D、A、B、C 5个IgG结合结构域。构建了原核表达载体pET28a(+)-SPA,经IPTG诱导,表达出分子质量约35.0ku的SPA蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPA蛋白,Western-blot分析表明纯化的SPA蛋白具有生物学活性。