猪红细胞CR1-like膜分布状态的初步研究

为进一步研究猪红细胞的天然免疫调控机制,本研究合成免疫抗原肽段,制备获得了猪CR1-like单克隆抗体,并应用CR1-like单克隆抗体通过荧光免疫细胞化学技术观察猪红细胞CR1-like的天然分布状态,运用流式细胞检测技术检测了膜流动性变化对猪红细胞CR1-like发挥免疫黏附功能的影响。结果显示,于荧光显微镜下观察,猪红细胞表面可见绿色荧光,且经膜固定处理的猪红细胞表面的绿色荧光分布呈片状,未经膜固定处理的猪红细胞表面的荧光点呈颗粒状分布,较膜固定组分布明显成簇化;流式细胞仪检测荧光强度发现,膜固定组、未固定组均明显高于空白对照组,差异极显著(P0.01);同时未固定组平均荧光强度明显高于膜固定组,差异极显著(P0.01)。证实天然状态下猪红细胞表面的CR1-like分布呈分散状态,发挥免疫功能时,CR1-like表现出多价高效的结合特性,其分布状态表现为颗粒样成簇分布。     

猪红细胞类补体受体Ⅰ型膜结合蛋白的筛选

本研究旨在鉴定猪红细胞类补体受体Ⅰ型(complement receptor 1-like,CR1-like)的膜结合蛋白,以期为探讨CR1-like在膜上分布的分子基础提供理论数据。采用免疫磁珠沉淀的方法纯化猪红细胞CR1-like,利用还原性SDS-PAGE电泳及Western-blot试验,得出猪红细胞CR1-like的分子大小;利用质谱技术对纯化的CR1-like免疫沉淀复合物进行鉴定,并对质谱数据进行相关分析。CR1-like免疫沉淀复合物的还原性SDS-PAGE和Western-blot的鉴定结果显示,CR1-like分子大小约为50 ku;CR1-like免疫沉淀复合物的质谱鉴定筛选出117个候选蛋白,根据肽段数、特异肽段数、序列覆盖率、分值等及对候选蛋白的生物信息学分析筛选出FERMdomain-containing protein作为候选蛋白进行下一步试验。上述结果表明,本研究成功建立了免疫磁珠沉淀CR1-like方法,并筛选出CR1-like的膜结合候选蛋白。     

动物红细胞免疫功能的研究进展

20世纪 5 0年代 ,Nelson[1] 首次发现红细胞具有免疫黏附功能 ,黏附的复合物更易被白细胞吞噬。6 0年代有关研究证实 ,人类红细胞所具有的免疫黏附功能是通过补体C3b受体实现的。 70年代在人红细胞上分离纯化了Ⅰ型补体C3受体 (CR1) ,其总数的 95 %以上都在红细胞膜上。Siegel等[2 ] 在前人研究的基础上提出了红细胞免疫系统 (RCIS)的新概念 ,随后红细胞免疫功能的研究发展迅速。现已证实 ,红细胞具有黏附、杀伤抗原 ,清除免疫复合物 ,参与机体免疫调控的作用 ,而且其自身存在完整的自我调控系统 ,是完整机体免疫系统中的重要组成部分。…     

鸡血型系统对红细胞免疫功能的影响

采用狼山鸡、海兰W-36鸡、AA肉用种鸡、南京当地鸡研究了各血型系统因子对鸡红细胞免疫功能的影响.结果表明,狼山鸡、南京当地鸡的CR1花环率显著高于海兰W-36、AA肉用种鸡,但红细胞免疫物花环率在各品种与血型因子相关性无显著差异(P＞0.05);带有B2、B21、B365、B614因子的鸡,其红细胞CR1花环率高于带D15、A653、B13因子的鸡,但在各品种鸡中有很大差异;本文还分析了红细胞免疫功能与遗传抗性的关系,提示鸡的红细胞免疫功能CR1花环率与鸡的抗马立克氏病(MD)特性呈一定的正相关.     

猪带绦虫Ddi1-like蛋白的真核表达及其抗血清的制备

为了对DNA损伤诱导蛋白1(Ddi1-like)基因功能进行研究,本研究参考GeneDB中猪带绦虫基因组注释信息,通过设计5′和3′端特异性引物,利用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得全长cDNA,并在毕赤酵母GS115中进行诱导表达;将纯化后的Ddi1-like重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清。结果,成功利用RACE获得Ddi1-like基因的全长cDNA序列;在真核表达系统中,绦虫上的Ddi1-like重组蛋白获得表达;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得重组蛋白即为Ddi1-like蛋白;免疫后获得抗血清,其效价达到1∶12 800。上述结果为后续研究Ddi1-like蛋白的酶切活性研究提供了基础。     

猪链球菌2型对红细胞的黏附及溶血作用

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)感染过程中对血液红细胞(RBC)损害及其机理,本研究采取无特定病原微生物感染的猪血液制备RBC悬液,根据预试验选用SS2∶RBC感染比(MOI)为100的SS2,分别体外感染RBC 0.5、1、1.5、2 h,光镜下观察BRC的形态变化;用G iem sa染色、CF D A-SE荧光标记检测SS2对红细胞的黏附和损伤,流式细胞仪分析不同作用时间的黏附率,real-time PCR检测SS2相关黏附因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、荚膜多糖(CPS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、纤连蛋白和纤维蛋白结合蛋白(FBPS)及溶血因子溶血素(Sly)的转录水平。结果显示,SS2感染后第0.5~1小时,其主要黏附RBC,细胞呈现棘突样病变,少量细胞肿胀,出现轻微溶血,黏附率分别为18.7%和46.3%;感染后第1.5小时,SS2不仅可以黏附RBC,且多数细胞溶血,RBC开始发生破裂,黏附率可达到91.7%;感染后第2小时,细胞几乎全部破裂。MRP和CPS2J转录水平在感染后第0.5~1小时增高,并与黏附率呈正相关,感染后第2小时表达水平下降;Sly转录水平在感染后第0.5~2小时持续增加,与溶血现象呈正相关;GAPDH和FBPS在感染过程中变化不显著(P0.05)。结果表明,SS2感染早期可对RBC产生黏附和溶血作用,先为黏附作用,后为溶血作用,且作用过程较快;主要参与黏附因子为MRP和CPS2J,溶血因子为Sly;GAPDH和FBPS是否参与SS2对RBC的黏附与溶血仍需证实;本试验结果为研究SS2传播和致病机制提供了重要的理论依据。     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.     

高硒对雏鸡红细胞免疫功能红细胞总数及血红蛋白含量的影响

将1日龄艾维菌肉鸡健雏300只随机分为5组,分别以基础日粮(含硒0.2mg/kg)和高硒日粮(含硒1、5、10、15mg/kg)饲喂6周,观察研究了高硒对红细胞免疫功能、红细胞总数和血红蛋白含量影响的动态变化.结果显示,当日粮中硒含量超过5mg/kg时,IC花环率升高,C3b受体花环率、红细胞总数和血红蛋白含量降低.表明,雏鸡摄入过量硒会导致红细胞免疫黏附功能降低,并表现贫血症状.     

锌中毒对天府肉鸭红细胞免疫功能的影响

通过人工复制天府肉鸭锌中毒病理模型 ,测定锌中毒对不同日龄鸭红细胞C3b受体(C3bRR)花环和免疫复合物花环 (ICR)率的影响。结果表明 ,锌中毒使鸭红细胞表面补体受体CR1数目减少或活性降低 ,血清循环免疫复合物增高 ,红细胞免疫功能受损。     

表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性的研究

为探究表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)纤突糖蛋白(S1)的重组乳酸乳球菌口服免疫动物诱导的特异性免疫应答,本研究从PEDV SDLY株中扩增得到S1基因序列,构建pMG36e-S1重组质粒并将其电转至乳酸乳球菌MG1363感受态细胞中,制备表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组乳酸乳球菌。应用SDS-PAGE、Western-blot鉴定目的蛋白的表达。将重组菌口服免疫新西兰大白兔,中和试验检测小肠黏膜和血清中的中和抗体效价,间接ELISA方法测定血清中特异性IgG。结果显示,该重组菌能够有效引起动物体产生较高水平血清IgG和一定量的黏膜免疫中和抗体,表明该重组菌表达系统能刺激动物系统产生免疫应答,具有作为口服疫苗的潜在应用价值。     

犬呼肠孤病毒1型BJ-JB-3株的分离鉴定

从临床表现呼吸道症状的病犬血液中分离获得了1株病毒,采用细胞培养、血凝及血凝抑制试验、中和试验、免疫电镜观察、免疫荧光抗体试验进行了鉴定.结果显示,该病毒能使MDCK和Vero细胞产生明显的细胞病变(CPE),能凝集人O型红细胞和猪红细胞;能被呼肠孤病毒1型血清所中和,病毒粒子呈圆形,有实心和空心两种粒子,将感染细胞用抗呼肠孤病毒1型血清及荧光抗体染色后见明显的绿色荧光.表明,所分离的病毒为呼肠孤病毒1型.     

表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究猪流行性腹泻病毒中和抗原位点(COE)基因在乳酸菌中的表达情况,进而探讨重组乳酸菌的免疫原性。将COE基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG-1中,构建重组表达载体pPG-1-COE,并将其电转化入干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中,应用Western-blotting、间接免疫荧光染色和全细胞ELISA检测重组蛋白的表达情况,用重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠,测定免疫应答水平。结果表明,COE可在构建的重组干酪乳杆菌表达系统中表达,目的蛋白定位于细胞表面。在免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P0.01);血清具有中和活性(1∶12);脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P0.01)。证实,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。     

GCNF在牦牛睾丸不同发育阶段中的表达与定位

生殖细胞核因子(GCNF)是核受体超家族的一员。相关研究发现,GCNF在睾丸和卵巢中高表达,可能在配子减数分裂中发挥作用。为探究GCNF在牦牛睾丸中的表达与定位,采集牦牛不同发育阶段(幼年、成年、老年)的睾丸组织,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测GCNF基因在组织中的相对表达量;采用Western-blot(WB)检测GCNF蛋白在不同年龄阶段睾丸中的表达水平;免疫组织化学方法分析GCNF在牦牛睾丸分布特征。qRT-PCR和WB检测结果显示,GCNF在牦牛睾丸不同年龄阶段均有表达,且表达存在差异性。幼年期GCNF在基因水平和蛋白水平表达量最高且显著高于成年期和老年期;老年期显著高于成年期,成年期表达量最低。免疫组织化学结果显示:在睾丸不同发育阶段GCNF的表达定位无明显差异,主要在生精细胞和圆形精子细胞中表达,间质细胞和支持细胞中也有少量表达。上述研究结果表明,GCNF可能参与精子的发生及分化变形,这为牦牛生殖生育研究提供了理论基础和新的依据。     

伪狂犬病弱毒疫苗的研究——接种猪的细胞免疫应答

本文报道了12头130日龄伪狂犬病弱毒疫苗(PRV_(FB))接种杂交猪在2个月内细胞免疫应答的动态变化。其结果:PRV_(FB)致敏的猪外周血淋巴细胞(L.C.)对PHA的应答出现两个峰,分别出现在免疫后的7和21天;而L.C对同源抗原(PRV_(FB))的应答缓慢上升,在第21天形成唯一的峰值,直到90天,其应答能力还显著高于免疫前的水平(P<0.05)。其血清中和抗体指数在免疫后4天就达到1.9(Lg),同样在21天形成峰值,而到60天,其中和指数也显著高于免疫前水平(P<0.01)。显而易见,PRV_(FB)既能刺激机体产生中和抗体,又能产生细胞免疫,并且能够维持相当长的时间。证明PRV_(FB)是一种较好的伪狂犬病弱毒疫苗。     

奶牛胎衣不下与胎儿胎盘中血管紧张素Ⅱ受体1表达的相关性

通过对胎儿胎盘中血管紧张素Ⅱ受体1(AT1-R)m RNA相对表达量的比较,分析奶牛胎衣不下(RFM)与AT1-R表达的相关性,探讨奶牛胎衣不下的发生机制。将奶牛分为RFM组与胎衣正常脱落(NRFM)组,利用RT-PCR将奶牛胎儿胎盘中AT1-R基因进行扩增,采用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测RFM和NRFM的奶牛胎儿胎盘组织中AT1-R基因m RNA相对表达水平的差异。结果显示,扩增后的AT1-R基因片段与Genbank中登录的核苷酸序列同源性为100%,奶牛RFM组的AT1-R基因m RNA转录水平明显低于奶牛NRFM组(P0.01)。结果表明,AT1-R基因m RNA的转录水平与RFM的发生密切相关。     

鸡肠相关性淋巴组织中IFN-γ和IL-2 mRNA表达的动态变化

通过实时荧光定量PCR方法,检测鸡在胚胎时期和出壳后初期肠道相关性淋巴组织(GALT)中IFN-γ基因和IL-2基因mRNA的表达水平,从而了解鸡GALT免疫功能的建立情况并反映鸡在此阶段的免疫状态。结果显示,胚胎20日龄和出壳后1日龄各肠段GALT中均有少量IL-2mRNA和IFN-γmRNA的表达。盲肠扁桃体、直肠和食管扁桃体中IL-2基因的表达水平在出壳后4日龄时显著升高(P<0.05),而在7日龄时又略有下降。除食管扁桃体外,各肠段GALT中IFN-γmRNA的表达水平在4日龄时显著升高(P<0.05),而空肠、回肠和直肠中其表达水平在7日龄时又显著下降(P<0.05)。各肠段在第2周内IL-2基因和IFN-γ基因表达水平迅速升高,并在14日龄时达到最高峰,之后各日龄都趋于稳定。另外,各日龄同一肠段IFN-γ基因的表达水平要明显高于IL-2基因的表达水平。证实,鸡GALT在出壳后4日龄就初步具有细胞免疫功能,直至第2周尤其是14日龄时其功能基本达到成熟水平。     

氢氧化铝纳米颗粒对鸡新城疫抗原的免疫佐剂效应

以新城疫病毒为抗原,制备纳米氢氧化铝和常规氢氧化铝佐剂灭活疫苗,分别免疫20日龄雏鸡,比较了免疫后2～24 d的抗体效价和外周血淋巴细胞CD4、CD8分子mRNA的表达水平。结果显示,纳米氢氧化铝佐剂组抗体效价在免疫后第10 d达到峰值,为6.67±0.58,免疫保护期超过9 d,常规氢氧化铝佐剂组抗体效价在免疫后第10 d达到峰值,为4.33±0.58,免疫保护期小于7 d;与常规氢氧化铝佐剂组相比,纳米氢氧化铝佐剂组免疫后4～17 d的CD4以及10～17 d的CD8分子mRNA的表达水平显著提高,在峰值时后者的表达量为前者的2.0和1.9倍。结果表明,纳米氢氧化铝佐剂能辅佐鸡体产生比常规氢氧化铝佐剂更强烈的体液免疫和细胞免疫。     

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响

将携带O型FMDVChina 99株P1 2A、部分 2B及 3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDVChina 99株 3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素 (PHA)刺激后的增殖活性 ,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化 ,并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明 ,FMDDNA疫苗与 3D蛋白共同免疫豚鼠后 ,抗体水平没有明显提高 ,攻毒后的保护率为 2 5 %。     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位重组腺病毒的免疫保护性研究

为了评估联合表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因和具有免疫原性的T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE的免疫保护效果,将20头抗体和核酸均为阴性的断奶仔猪随机分为4组,包括2组免疫组、攻毒对照组和阴性对照组。2组免疫组分别免疫重组腺病毒rAd-ORF2-TCE和rAd-ORF2,2周后加强免疫1次,一免后第28天攻毒。通过PCV2特异性抗体水平的检测以及血清中和试验评估疫苗的体液免疫反应水平,通过外周血T淋巴细胞亚群的动态变化以及细胞因子分泌水平评估疫苗免疫诱导的细胞免疫反应水平。结果表明,与其他对照组比较,重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够诱导猪体产生更为强大的体液免疫和细胞免疫水平。攻毒试验结果表明,rAd-ORF2-TCE能够有效抵抗PCV2感染。本试验结果进一步证实了构建的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够有效地诱导猪产生足够的免疫保护能力。     

犬瘟热病毒感染小鼠脾淋巴细胞所引起的主要基因表达情况的变化

采用基因芯片技术对正常小鼠淋巴细胞和犬瘟热病毒(CDV)感染后第7天的小鼠淋巴细胞基因表达的差异性进行了比较,从分子水平上探究了CDV感染机体后的免疫应答情况。结果显示,检测到364个差异表达基因,其中280个基因的表达水平升高,84个基因的表达水平下降。进一步以基因芯片中CDV感染后上调基因C-C型趋化因子受体2(CCR2)和下调基因CD14为研究对象,应用实时荧光定量方法验证基因芯片的结果,两者完全相符,说明芯片的筛查结果可靠。根据基因芯片的结果,采用Go注释系统和数据库查询,对364个差异表达基因进行功能注释,结果显示,差异表达基因主要与水解、结合、转运调控、信号传递、代谢、结构组成等有关,其中CCR2基因、CD14基因、丝裂原活化蛋白激酶1(MAP3K1)基因、CD69基因等被鉴定为差异表达基因。上述结果为进一步阐明CDV感染后机体的免疫应答机制奠定了基础。