重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌表达质粒的构建及表达

本试验通过构建重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌,诱导产生外源蛋白,为减毒鼠伤寒沙门菌作为FMDV VP1口服活载体疫苗可行性提供研究基础。将A型FMDV VP1基因克隆后测序,根据减毒鼠伤寒沙门菌的密码子偏好性进行优化,再将其插入表达载体p YA3341之中构建重组质粒p YA3341-VP1。然后,将构建的重组质粒p YA3341-VP 1采用化学法转入大肠杆菌X6212中,筛选阳性克隆。经PCR鉴定和双酶切鉴定正确后,将重组质粒p YA3341-VP1依次转入减毒鼠伤寒沙门菌中间宿主X3730和表达宿主X4550中,在转入X4550后第3.5小时加入IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE与Western-blot分析。结果表明,成功构建了重组减毒沙门菌X4550-VP1载体,且表达产物大小为23 ku,与预期目的蛋白大小相符。上述结果表明,FMDV VP1基因在减毒鼠伤寒沙门菌中得到了成功表达。     

表达禽流感病毒HA2-DEC205的减毒沙门菌DNA疫苗载体的构建与初步研究

构建表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型重组减毒沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-sec)和χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec),将其免疫小鼠,通过流式细胞术检测免疫细胞的变化。结果表明,沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec)能够提高CD3+CD4+T细胞分泌细胞因子IL-4、IFN-γ的水平。这说明重组沙门菌免疫小鼠能够激活机体的免疫系统,诱导发生一定的免疫反应。     

稳定表达PRRSV ORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌的构建及其生物学特性

为构建能稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌,以p MD19-T-ORF5-7为模板,PCR分别扩增出ORF5和ORF6,将2个基因先后插入表达载体PYA3493,构建了重组质粒PYA3493-ORF5-ORF6。PCR、双酶切及测序结果表明,成功构建了重组质粒p YA3493-ORF5-ORF6。将该重组质粒电转至减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1基因缺失株,获得PRRSVORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6),并对该重组减毒猪霍乱沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。进一步对重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)研究发现,其生长速度比强毒株C78-1明显减慢,与ΔcrpΔcyaΔasd C78-1缺失株及ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)互补菌株基本一致。在体外连续传代能够稳定遗传ORF5-ORF6融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到ORF5-ORF6蛋白条带,且经Western-blot分析证实,重组菌共表达的GP5和M蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。以上结果表明,能稳定携带ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)构建成功,为开发猪繁殖与呼吸综合征和仔猪副伤寒基因工程二联疫苗奠定了良好基础。     

表达IBDV VP2蛋白的重组弱毒肠炎沙门菌的构建及其免疫原性的初步研究

为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病(IBD)的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌(rSD),再以其为亲本菌株构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的重组肠炎沙门菌(Se-VP2)。以1日龄SPF雏鸡为实验动物,分别检测了重组菌的致病力及免疫效果。结果显示,rSD株和Se-VP2株与野生株生长速度一致,体外连续传20代,基因缺失株和重组株均可稳定遗传;Western-blot表明,Se-VP2株可稳定表达VP2蛋白;构建的重组菌rSD株和Se-VP2株对SPF雏鸡无致病性,半数致死量(LD50)大于1.0×1010CFU,且重组菌Se-VP2株免疫动物后可同时诱导产生针对IBDV和沙门菌的抗体;重组菌Se-VP2株可以诱导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4,并能刺激外周血淋巴细胞的增殖分化;攻毒保护性试验结果显示,Se-VP2株免疫动物后可对IBDV和沙门菌的感染提供100%的保护。结果表明,rfaH基因是沙门菌的毒力基因,重组弱毒肠炎沙门菌Se-VP2株作为疫苗候选株,对SPF雏鸡安全有效,为后续肠炎沙门菌作为表达载体的研究奠定了基础。     

携带Apoptin的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统的构建

为研究减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin的特性,将Apoptin基因克隆入载体pYA3493-SopE,构建重组载体pYA3493-SopE-Apoptin,然后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,对该重组菌生长特性、生化特性、毒力和表达等特性进行分析;同时将重组菌体外感染B16F10黑色素瘤细胞,分析其介导Apoptin对B16F10的作用。PCR、酶切检测表明,携带Apoptin的重组减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-SopE-Apoptin)构建成功;生物学特性分析发现,重组菌的生长特性、生化特性与缺失株ΔcrpΔasd SL1344和互补株ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-SopE)相近,与亲本株SL1344差异明显;腹腔感染重组菌的C57BL/6小鼠的LD_(50)为1.69×10~7CFU;在重组菌培养上清和感染的B16F10细胞内均可检测到SopE-Apoptin蛋白条带。进一步研究其介导Apoptin对B16F10细胞的作用发现,重组菌可抑制该细胞增殖,且具有MOI浓度梯度和感染时间依赖性;用TUNEL法可观察到TUNEL阳性细胞;Western-blot可在重组菌感染的细胞内检测到Caspase-9凋亡信号蛋白表达。以上结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统能够介导Apoptin蛋白的分泌性表达,且能够诱导肿瘤细胞B16F10的凋亡。     

稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌的构建及其基本生物学特性的测定

为构建能稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌,以pMD19-T-Apoptin为模板,PCR扩增出TAT-Apoptin融合基因,将其连接至pYA3493,构建了重组质粒pYA3493-TAT-Apoptin;然后将其电转至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd,并对该重组减毒沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。PCR和测序结果表明,成功构建了重组质粒pYA3493-TAT-Apoptin。进一步对重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-TAT-Apoptin)研究发现,其生长速度比强毒株SL1344明显减慢,与缺失株SL1344ΔcrpΔasd及互补菌株SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493)基本一致,且能够稳定遗传TAT-Apoptin融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到TAT-Apoptin蛋白条带。以上结果证明,能稳定携带TAT-Apoptin融合基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-TAT-Apoptin)构建成功,且该重组菌能分泌性表达TAT-Apoptin蛋白。     

表达破伤风毒素C片段的重组鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定

为构建表达破伤风毒素C片段基因的减毒鼠伤寒沙门菌,将编码破伤风毒素C片段的基因插入到asd 的组成型表达载体pYA3333,转化asd基因突变的E.coliX6212,获得重组质粒pYA3333-TetC,再将重组质粒通过电穿孔法转入宿主菌,构建成表达破伤风毒素C片段基因的平衡致死的鼠伤寒沙门菌X4550(pYA3333-TetC)。免疫印迹试验证实,该重组菌表达的蛋白与预期的目的蛋白一致。重组菌X4550(pYA3333-TetC)的稳定性试验表明,在体外培养100代后,随机挑选的重组菌落全部都能生长,重组菌X4550(pYA3333-TetC)的生长曲线测定表明,X4550(pYA3333-TetC)和X4550(pYA3333)的生长状态基本一致。动物试验证明,该重组菌是安全的,破伤风毒素攻击后能提供良好的保护作用。     

减毒沙门菌载体在肠道黏膜免疫方面的研究进展

为了更好地发挥减毒沙门菌活载体在肠道黏膜免疫中的优势作用,结合国内外的研究成果,论述了黏膜免疫系统的组成、肠道黏膜免疫机制和沙门菌侵染过程及其在DNA疫苗方面的应用等几方面内容,为研发更有效的黏膜免疫活载体疫苗奠定了理论基础。     

TSOL18抗原重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗对小鼠的免疫保护作用

用构建好的活栽体疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)免疫小鼠,检测小鼠血清中IgG、IgM和肠液中IgA抗体的产生及各免疫组织重组疫苗株的分布情况,分析小鼠脾细胞亚型的分化,探讨了重组疫苗的免疫保护效果.结果显示,在免疫后第7 d,小鼠血清中有抗TSOL18 IgM产生,在二免后第28 d,gG的D492nm值达到0.645,在二免后第42 d,肠液中有抗TSOL18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种方式的免疫应答;小鼠免疫后第21 d在脾中仍能检测到大量的重组疫苗株,表明TSOL18重组蛋白的表达没有影响重组疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)的定居能力;免疫小鼠的CD4 、CD8 T淋巴细胞数目明显增多,D4 /CD8 T细胞比值也显著增高(P＜0.01),提示重组疫苗可能通过提高CD4 /CD8 T细胞比值来发挥免疫作用.     

携带猪流行性腹泻病毒S基因的减毒鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定

为构建可有效抵抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)入侵的诱导黏膜免疫反应的核酸疫苗,采用RTPCR方法扩增了PEDV SC-L株的S基因主要抗原编码区域(简称S1),插入pMD19-T载体,构建载体pMD19-T-S1,再将S1基因片段插入双启动子真核表达载体pVAXD中,构建了pVAXD-S1表达载体。经免疫荧光法鉴定S1基因可在COS-7细胞中正常表达后,将pVAXD-S1电转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,构建了携带S1基因的重组减毒沙门菌SL7207(pVAXD-S1),并对该重组菌株的生长曲线、携带质粒的稳定性、口服小鼠的安全性及目的基因在体内转录等特性进行了鉴定。结果显示,SL7207(pVAXD-S1)在含卡那霉素(100μg/mL)的培养环境中稳定性良好,以每只1×109 CFU口服免疫BALB/c小鼠具有良好的安全性,携带的S1基因能在小鼠回肠末端组织内正常转录及表达。本研究为深入开展减毒沙门菌疫苗菌株SL7207(pVAXD-S1)的免疫评价及构建PEDV与其他抗原基因联合免疫DNA疫苗奠定了基础。     

马流产沙门菌鞭毛重组蛋白FliC的原核表达及对小鼠的免疫保护试验

为研究马流产沙门菌新疆分离株鞭毛蛋白FliC(flagellin C)的免疫生物学特性及保护特性。本研究利用PCR技术扩增获得该菌的Fli C基因,并将其连接到原核表达载体p ET-28a(+)上,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western-blot检测与分析表达蛋白,并将纯化的重组蛋白免疫小鼠。结果显示,成功诱导表达了52 ku的重组蛋白,该蛋白第2次免疫小鼠第14天时血清中的特异性Ig G抗体效价可达1∶72 900,且抗体亚型以Ig G1为主,免疫小鼠的攻击保护率可达73%。结果表明,Fli C重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。为进一步开展马流产沙门菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

携带禽流感病毒DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门菌的免疫效力

将从重组质粒pVAX1-HA中扩增的HA基因和从pVAX1-HA-CpG中切出的HA-CpG基因分别克隆入pcDNA3.1(+)载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-HA和pcDNA3.1-HA-CpG。将上述重组质粒分别转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验检测发现HA基因可在COS-7细胞中表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pcDNA3.1-HA)和SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)。将重组菌分别以5×109CFU口服免疫1日龄鸡2次,重组菌免疫组产生的小肠黏膜抗体效价与空载体组及油乳剂灭活疫苗组间存在显著差异。攻毒免疫保护结果表明,SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)免疫组与空载体组之间存在显著差异,而SL7207(pcDNA3.1-HA)免疫组则与空载体组间无显著差异,说明CpG可增强DNA疫苗的免疫效果。     

减毒沙门菌递呈的猪传染性胃肠炎病毒S基因与猪IL-6基因双启动子DNA疫苗的构建

从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表达S与IL-6基因的双启动子表达质粒pVAXD-S-IL-6,转染COS7细胞进行转录和表达鉴定。将质粒pVAXD-S-IL-6电转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6),并对重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)的体外稳定性和口服小鼠的安全性进行了鉴定。结果表明该双启动子真核表达质粒pVAXD-S-IL-6构建成功,RT-PCR检测到转染的COS-7细胞中2个目的基因的转录,间接免疫荧光试验结果显示表达产物可与猪抗猪传染性胃肠炎病毒血清发生特异性反应。重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)在含卡那霉素的抗性培养基中稳定性好,以1×109 CFU灌胃接种小鼠具有良好的安全性。本研究构建了猪传染性胃肠炎病毒的新型口服疫苗株SL7207(pVAXD-S-IL-6),为开展其免疫原性评价奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的表达纯化及其生物学特性的研究

为研究鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的生物学特性,利用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC基因,构建重组表达质粒p ET-32a-FliC,经大肠杆菌Rosetta(DE3)表达、镍离子亲和层析法纯化后用SDS-PAGE和Western-blot方法分析。重组蛋白与巨噬细胞RAW264.7共孵育,ELISA和CCK-8法分别检测巨噬细胞细胞因子和巨噬细胞增殖情况。重组蛋白免疫小鼠后不同时间点检测血清抗体效价和细胞因子水平。结果显示,鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC在大肠杆菌中呈可溶性表达,且可获得纯度较高的重组鞭毛蛋白。50 ng/m L和500 ng/m L重组鞭毛蛋白可刺激巨噬细胞增殖,同时促进巨噬细胞分泌IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α。重组蛋白免疫小鼠后效价在第3周达到1∶128 000,同时小鼠血清细胞因子的分泌量呈倒V型变化。研究结果为后续进一步研究FliC蛋白在细菌感染、侵袭和免疫方面的作用研究提供了参考数据。     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株的构建及动物免疫试验

为了构建表达猪瘟病毒E2蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株,亚克隆猪瘟病毒E2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建了重组质粒pYA3341-E2。将该重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E2),并对重组菌表达的E2蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析、测定其在体内外的稳定性、生长曲线、安全性及动物免疫试验。结果显示,重组菌能表达E2蛋白且表达的蛋白能与猪瘟病毒阳性血清特异性结合。在体外营养选择压力下,重组菌株在体外可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾。小鼠口服试验证实重组菌无毒性,安全可靠。动物免疫试验表明,口服重组菌免疫猪产生了抗E2蛋白抗体。淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱导机体产生较强的细胞免疫应答。结果表明,成功构建了能稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究猪瘟口服基因工程疫苗奠定了基础。     

松鼠猴源沙门菌的分离鉴定及生物学特性研究

从扬州某动物园病死松鼠猴的病料中分离出疑似沙门菌株,经革兰氏染色镜检、生化试验、PCR扩增沙门菌invA基因和血清型鉴定,再对该菌株的生物学特点如致病性、生物被膜形成能力和药物敏感性进行研究。结果表明,从送检猴肝中分离出的菌株,革兰氏染色为阴性短杆菌;能够发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等,不能发酵乳糖和蔗糖,V-P反应阴性,MR阳性;PCR检测inv A基因为阳性,确认分离菌为沙门菌;血清型鉴定为鼠伤寒沙门菌。致病性试验采用灌胃方式攻毒小鼠,18 h后小鼠死亡。生物被膜检测结果表明,该分离菌株有较强的生物被膜形成能力。药敏结果显示,分离菌对头孢噻肟、头孢哌酮和卡那霉素等敏感,对庆大霉素、链霉素和复方新诺明耐药。     

肠炎沙门菌效应蛋白AvrA的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)avr A基因功能及其在感染过程中的表达分布情况,本研究通过PCR技术克隆获得了avr A基因,并构建了肠炎沙门菌Avr A原核表达载体p Cold-avr A,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;表达蛋白经纯化后免疫小鼠获得Avr A多克隆抗体,通过Western-blot检测了抗体特异性。结果显示,成功构建了表达载体p Cold-avr A,并获得了纯化的Avr A蛋白,成功制备了小鼠抗Avr A蛋白的多克隆抗体,可用于检测细菌Avr A蛋白的表达。本研究成功获得纯化的Avr A蛋白及其多克隆抗体,为进一步探讨Avr A在肠炎沙门菌感染过程中所发挥功能奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗候选株,在单缺失株SL1344Δcrp的基础上,运用自杀性质粒介导的细菌同源重组技术敲除sipB基因,构建了双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB。PCR及测序结果表明SL1344ΔcrpΔsipB构建成功。生物学特性研究表明,SL1344ΔcrpΔsipB血清型未发生变化,遗传性稳定。与亲本株SL1344相比,双缺失株的生长速度明显减慢,毒力降低了约99.9%以上。免疫保护效力试验显示,6周龄昆明小鼠口服免疫SL1344ΔcrpΔsipB后第17天,利用鼠伤寒沙门菌野生株攻毒,保护率为60%;免疫后第21天血清抗体效价达到峰值。上述结果为进一步研制安全有效的鼠伤寒沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。     

表达Ⅶ型新城疫病毒F蛋白的延迟裂解型沙门菌DNA疫苗载体的构建

为了构建表达新城疫病毒Ⅶ型F蛋白的延迟裂解型沙门菌载体,本试验首先通过PCR技术将Flag标签携带到pUC-F-opt片段中,构建出pUC-F-opt-Flag片段,再将构建好的片段克隆到沙门菌载体pYA4545中,构建重组质粒pYA4545-pUC-F-opt-Flag,并将重组质粒转染HEK-293 T细胞,收集细胞总蛋白。通过Western-blot检测目的蛋白的表达情况。同时将真核表达质粒转染Caco2细胞,并以间接免疫荧光试验检测蛋白表达。结果显示,成功构建了重组质粒pYA4545-pUC-F-opt-Flag,经Western-blot和间接免疫荧光法检测目的蛋白成功表达,为后期试验奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344 sseK2基因的克隆表达及生物信息学分析

为研究鼠伤寒沙门菌SL1344株SseK2蛋白的生物学特性,通过PCR扩增sseK2基因,构建原核表达质粒pET-32a-sseK2,经大肠杆菌BL21(DE3)表达、纯化后经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,对sseK2基因编码的氨基酸进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌SseK2蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,纯化获得较高纯度的蛋白。生物信息学分析显示,SseK2蛋白为可溶性蛋白,由348个氨基酸组成,分子质量约39.57 ku。该蛋白不含信号肽、无跨膜区,为膜外蛋白,包含4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、56个磷酸化位点、15个B细胞线性结合位点和8个T细胞结合位点以及10个二硫键。其蛋白二级结构中以α-螺旋(Hh)占33.05%,无规则卷曲(Cc)占27.30%为主。成功构建了原核表达载体,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究sseK2基因的生物学功能及在沙门菌致病机制中的作用奠定了良好基础。