捕食性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白质的生化性质研究

为纯化捕食性真菌Duddingtonia flagrans分泌的胞外蛋白酶并研究其生化性质,利用枸橼酸液体培养基对D.flagrans进行培养,以灭菌的马圆线虫进行诱导,之后用盐析法粗提培养液,再使用Sephadex G-100分子筛进行层析纯化,最后对纯化物进行最适pH、温度及蛋白酶抑制剂的抑制试验。结果显示,被纯化出的3种胞外蛋白酶的分子质量分别为38、63、19ku;在pH 6.0~7.0、45~55℃条件下,其活性最高;它们都对酶抑制剂菲罗啉和抑肽素非常敏感,其中38ku的蛋白酶对抑制剂PMSF也很敏感。上述结果为进一步研究捕食性真菌分泌的胞外蛋白酶在杀线虫过程中的作用以及今后在生产中的具体应用提供了重要参考依据。     

捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans胞外蛋白质的产生及其杀虫作用的研究

将捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans接入含有不同诱导物的LMZ培养基和枸橼酸液体培养基中,然后进行为期6d的培养并收集发酵液,进而测定其中蛋白质的质量浓度和蛋白酶活性及磷酸酶活性,并用发酵液进行杀虫试验。结果显示,动物寄生性线虫诱导的枸橼酸培养基发酵液中蛋白质的质量浓度最高可达381.4mg/mL,蛋白酶和磷酸酶比活性最高,分别为9.48U/mL±0.03U/mL和38.30U/L±0.04U/L,对线虫的致死率为50.11%±11.8%,均明显高于相应的对照组;同时发现,D.flagrans发酵液对蝇蛆的致死率最高,可达40.56%±0.13%。结果表明,在D.flagrans发酵液中含有杀虫物质。研究结果为以后研究捕食线虫性真菌的化学杀虫机理提供了重要依据。     

捕食线虫性真菌生长特性的研究

对捕食线虫性真菌菌丝、分生孢子、厚垣孢子、捕食性结构的发育过程和特点及其在 0 .4g/L玉米粉琼脂固体培养基和液体培养基中的生长情况进行了研究。结果表明 ,捕食线虫性真菌菌丝在 0 .4 g/L玉米粉琼脂固体培养基上呈树枝形放射状生长 ,有的菌株还可以在 0 .4g/L 玉米粉液体培养基中呈絮状生长 ;分生孢子位于垂直的分生孢子梗顶端或近顶端部 ,多数出现在菌丝的生长后期 ;厚垣孢子在菌丝上呈插入性生长 ,在老的培养基中容易发现 ,且与捕食线虫性真菌的种类有关 ;捕食性结构在受到活线虫幼虫的刺激之后才会产生 ,而线虫虫卵与成虫并不能导致捕食性结构的产生。     

嗜线虫真菌捕食绵羊粪便中捻转血矛线虫幼虫的效果观察

采集感染捻转血矛线虫等胃肠道线虫绵羊粪便培养、分离三期幼虫,加入嗜线虫真菌纯培养物中,72 h?4%的幼虫被真菌菌丝缠绕和捕获;将该真菌培养物与感染捻转血矛线虫等胃肠道线虫的绵羊粪便混合后共同培养10 d,粪便培养物中的三期幼虫减少82%.     

杀线虫性真菌的分类与形态

杀线虫性真菌 (Nematode destroyingfungi)是广泛存在于自然界生态系统中的一类小的生物种群。它们大都生活在土壤、植物落叶、朽木、苔藓及动物粪便中 ,至今已发现有 2 0 0余种[1] 。有的主要以不同种类自由生活的线虫为食 (专性寄生性真菌 ) ;有的以腐生生活为主 ,兼带吃一些活的线虫 (兼性寄生性真菌 )。大部分属于半知菌亚门 (Deuteromycoti na)、丝孢菌纲 (Hyphomycetes)。在其他一些真菌亚门及纲中 ,如壶菌纲 (Chytridomycetes)、短担子菌纲(Phragmobasidiomycetes)、接合菌纲 (Zygomycetes)、卵菌纲 (Oomycetes)也有发现。根据杀…     

厚垣普可尼亚菌胞外蛋白酶的诱导及发酵液生化性质的研究

为探讨不同培养基对厚垣普可尼亚菌胞外蛋白质的诱导效果及相应发酵液的生化性质,以更好地利用该菌对家畜寄生性线虫进行生物防治,在本实验室前期研究的基础上,设计使用3种常用真菌液体培养基对厚垣普可尼亚菌进行发酵培养,并检测发酵液的蛋白质质量浓度、蛋白酶活性,磷酸酶活性及杀虫效力等,筛选出适合该菌液体培养的最佳培养基。结果表明,在3组培养基中,LMZ培养基组的蛋白质种类最丰富,蛋白质质量浓度(2 320 mg/L±10.00 mg/L)、蛋白酶活性(2.95 U/m L±0.23 U/m L)与磷酸酶活性[1.546 U/100 m L±0.035 U/100 m L(酸性磷酸酶)和0.516 U/100 m L±0.069 U/100 m L(碱性磷酸酶)]都较高,对线虫的杀虫率也是3种培养基中最高的,可达60%,与其他各组间差异极显著(P0.01)。因此从生物防治的角度,在试验的3种培养基中,以LMZ液体培养基为最佳选择。这一发现可为今后对厚垣普可尼亚菌液体发酵培养、杀虫物质的产生以及作用机制进行深入探究提供重要基础资料。     

环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白的亚细胞定位分析

为研究微线体-棒状体蛋白在环形泰勒虫裂殖体及其在感染环形泰勒虫裂殖体的淋巴细胞中表达情况及亚细胞定位,应用Western-blot验证了该蛋白多克隆抗体的特异性;通过条件摸索找出最佳比例的固定剂和最佳一抗、二抗的工作浓度;利用优化好的条件对微线体-棒状体蛋白进行间接免疫荧光试验,用激光共聚焦技术确定该蛋白在环形泰勒虫裂殖体和其在感染的淋巴细胞中表达及亚细胞定位。结果表明,微线体-棒状体蛋白主要定位于环形泰勒虫裂殖体的表面,而在宿主淋巴细胞细胞质中分布较少。     

四次群发性牛焦虫病的调查

我县自1980年6月至1983年6月的三年间,曾四次相继在菜元公社的雁岭关和官上大队、店子公社的社办农场、宫前公社的菜家湾大队的牛群中,发生群发性焦虫病,共计83头,约占当地总头数的90.2％左右,虽经多方治疗抢救,仍有22头归于死亡,造成损失达12600余元给当地群众的生产和生活造成较大的影响,也给养牛业带来严重威胁。为了尽快地采取措施,控制该病在我县境内的传播和发生,我们对疫源地、诱发原因和流行情况进行了调查。     

乳牛非典型性环形泰勒虫病的诊疗

泰勒虫病是哺乳动物的一种血液寄生虫病 ,常呈地方性流行 ,乳牛感染后病死率较高 ,对养牛业危害很大。新疆一些地区每年 5～ 8月常发生乳牛环形泰勒虫病。近年来 ,笔者等在乌鲁木齐及石河子地区接诊了一些非典型性乳牛环形泰勒虫病 ,此类病例与以往临床上见到的泰勒虫病有较大差异 ,常被误诊 ,以致耽误治疗时机而导致乳牛死亡。1　临床症状2 0 0 1年 6月 ,石河子市 1头 2岁的中国黑白花牛发病 ,其主要临床表现为精神不振 ,食欲废绝 ,反刍停止 ,行动迟缓 ,鼻镜干燥 ,眼结膜苍白 ,两眼睑有黄豆粒大的出血斑。心跳加快 ,90～ 110次 /ｍｉｎ ;呼…     

环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因侧翼序列的hiTAIL-PCR扩增及其生物信息学分析

为扩增环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因的侧翼序列,从感染环形泰勒虫的淋巴细胞系中提取RNA,反转录合成第1链cDNA。以该cDNA为模板,利用高效热不对称交互PCR法(hiTAIL-PCR)进行扩增,将目的片段连接到pGEM-T Easy载体并进行测序。结果显示,获得了环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白基因的5′端侧翼序列,该序列编码894个氨基酸。生物信息学分析结果表明,该蛋白具有信号肽,信号肽剪切部位位于第19~20个氨基酸残基之间,很可能是一种分泌蛋白;经TMHMM2.0预测,该蛋白在第875~892位氨基酸残基部位具有典型的跨膜结构;Motifscan预测的结果显示,环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白存在2处N-糖基化位点(153NLSF、333NESM)和15处CK2蛋白激酶磷酸化位点;在该蛋白第500~650位氨基酸残基部分具有较高的抗原性,推测可能是该蛋白与其他蛋白发生相互作用的区域。     

环形泰勒虫微线体-棒状体基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了解环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白的生物学特性,通过生物信息学分析,选取环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白特异性和抗原性最高的一段开放阅读框进行RT-PCR扩增,将所获基因片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达,将表达产物纯化后免疫家兔制备该蛋白的多克隆抗体。通过SDS-PAGE和Western-blot分析该基因的原核表达情况和表达产物的反应原性。生物信息学分析发现,该蛋白第470~650位氨基酸残基的特异性和抗原性最高。对诱导条件的摸索发现,在37℃、1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h表达量最高,表达产物大小为43ku。Western-blot结果显示,该蛋白能被环形泰勒虫阳性的牛血清所识别,具有很好的反应原性。本研究制备的多克隆抗体为后期研究微线体-棒状体蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

双峰驼诱导排卵因子氨基酸组成的分析

分别测定了纯化的公驼精清诱导排卵因子７的活性和固定部分肽类的小肽氨基酸组成,证明活性位序易降解,这一特性与其所含的丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸等有关。     

吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫内转录间隔区基因序列的测定与系统进化分析

自试验感染吕氏泰勒虫(渭源株)和尤氏泰勒虫(隆德株)绵羊的血液中纯化虫体,提取虫体基因组DNA,通过PCR扩增内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2 rRNA)基因,然后进行测序,构建了系统发生树并与GenBank中各种动物梨形虫的ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因序列进行比较.结果显示,这两种泰勒虫的ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因大小为817～842 bp,同源性高达96.8%,分布在同一大枝上.通过比较ITS基因的同源性,尤其是ITS2基因的变异性,可以区别这两种泰勒虫与其他梨形虫.     

羊泰勒虫中国株裂殖子的蛋白分析

采用SDSPAGE和Westernblotting试验对羊泰勒虫临潭株、隆德株、张家川株和夏河株裂殖子蛋白进行了分析。SDSPAGE结果显示,羊泰勒虫临潭株与隆德株的亲缘关系较近;张家川株与夏河株的亲缘关系也比较近。4个虫株的阳性血清分别与4个株裂殖子蛋白的Westernblotting试验结果表明,4个株虫体的阳性血清与临潭株和张家川株的裂殖子蛋白在38ku处有共同反应。提示38ku蛋白多肽有望成为特异性诊断抗原,为重组疫苗的研究提供依据。     

牛羊蜱传性血液原虫超微结构研究——大巴贝斯虫的超微结构观察

电镜观察显示，人工感染大巴贝斯虫的黄牛红细胞有一层绒毛外衣。虫体有双梨子形、单梨子形和形状多变的滋养体。细胞质内有前、后极地环及微丝体、棒状体、线粒体和内质网。除核外还观察到一个球形体。典型的双梨子虫体可见有双生的子细胞在末端相连，维持一段时间后分离，形成单梨子形虫体。滋养体的形态是多变的。大巴贝斯虫红内期的超微结构与双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫相似。     

日本血吸虫童虫部分差异表达蛋白的质谱分析

应用蛋白质双向电泳技术和质谱技术对16日龄日本血吸虫童虫的可溶性蛋白进行分离、分析,得到了2 000±69个蛋白斑点,其中500±86个蛋白斑点与血吸虫雌虫和雄虫的蛋白所共有,童虫特异呈现的蛋白斑点有26±1个。对其中20个童虫特异呈现的蛋白斑点进行质谱和生物信息学分析的结果表明,它们代表了16种蛋白;对这些蛋白进行生物学功能预测的结果表明,它们可能与寄生虫的生物合成、能量代谢、信号传导和细胞构成等相关。     

我国牛蜱传性血液原虫的虫种调查和分布特征的研究

利用病原检查法对我国２６个省（区）的３１８４头牛进行了牛蜱传性血液原虫调查，并研究了不同生态地区虫种的分布特征。调查共发现双芽巴贝西虫、牛巴贝西虫、大巴贝西虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、突变泰勒虫和边缘边虫７种病原。双芽巴贝西虫分布于云南、贵州、四川等省，感染率为０．９７％～１．５％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。牛巴贝西虫分布于云南、贵州、湖南、湖北等省，感染率为２．３８％～５６．６６％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。大巴贝西虫分布于河南、甘肃、辽宁、新疆等省（区），感染率为１６．６５％～４０％，媒介蜱为长角血蜱和刻点血蜱。环形泰勒虫分布于宁夏、新疆、内蒙、甘肃等省（区），感染率为１７．２４％～３５．３０％，媒介蜱为残缘璃眼蜱。瑟氏秦勒虫分布于云南、贵州、广东、广西等省（区），感染率为３４．６７％～１００％，媒介蜱为长角血蜱。突变泰勒虫分布于贵州、新疆、西藏等省（区），感染率为４５％～５５％，媒介蜱为刻点血蜱。边缘边虫分布于云南、贵州、湖南、湖北等省，感染率为２０％～７９．３１％，媒介蜱为微小牛蜱和镰形扇头蜱。     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。     

大熊猫被毛可培养真菌的分离鉴定与系统发育学分析

为了掌握大熊猫体表被毛可培养真菌的分类情况,采用常规分离培养方法从不同月份(3、6、9、12月份)的大熊猫体表被毛中分离到165株真菌。通过形态学鉴定,用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR鉴定,并进行系统发育学分析。结果,利用ITS区序列进行的PCR鉴定可将大多数真菌鉴定到种,部分真菌只能被鉴定到属。本次试验共分离鉴定出165株真菌,其中毛孢子菌属(Trichosporon sp.)是本次试验中的优势种群,其菌株数最多,占29%;指间毛癣菌(Trichophyton interdigitale)、蒙氏毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、蜡蚧霉(Lecanicillium lecanii)等是本次试验的优势菌种。9月份样本分离得到的菌株数量最多,为50株,且包含种类最多,具有丰富的微生物多样性。3、6、12月份样本分离得到的菌株数量分别为38、38、39株。本研究结果极大地丰富了对大熊猫被毛可培养真菌种群的认识,将为大熊猫皮肤病的诊治提供参考。     

环形泰勒虫SPAG蛋白的原核表达及反应原性分析

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中进行表达,并对SPAG重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,获得的SPAG基因片段长度为882 bp,重组蛋白分子质量约为42 ku。反应原性分析显示,该重组蛋白可与环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,与中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应。本研究结果表明,SPAG蛋白有较好的反应原性和种特异性,可作为检测环形泰勒虫的候选抗原建立相应血清学诊断方法。