惠阳胡须鸡Ⅱ型干扰素基因在毕赤酵母中的表达及其产物活性分析

为了确定惠阳胡须鸡IFN-γ基因(chIFN-γ2)在毕赤酵母中表达的重组蛋白的抗病毒活性和蛋白的二级结构,将pGEM-T-chIFN-γ2重组质粒中的chIFN-γ2基因克隆到表达质粒pPICZαB上,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后的序列同源性分析,证明目的基因没有发生缺失、突变,并且插入方向正确。将重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达。重组IFN-γ的分子质量约为33 ku,表达量达0.604 mg/mL,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV的抗病毒活性为3.2×104U/mg。圆二色性分析表明,IFN-γ酵母重组蛋白属于典型的α螺旋蛋白,二级结构含量为:α螺旋55.1%,β折叠8.3%,转角13.9%,无规卷曲22.8%。采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-γ,并首次证明鸡IFN-γ重组蛋白属于典型的α型蛋白。     

捕食性真菌Duddingtonia flagrans线虫诱导发酵液的蛋白质组学分析

捕食性真菌Duddingtonia flagrans杀虫机理是近年来生物防制领域的热点,而对其发酵液中的蛋白质组进行深入分析和研究,有利于揭示D.flagrans杀线虫的生化机制。本研究首次采用基于液质联用的蛋白质组学非标记定量(label free)技术,对线虫幼虫诱导下的D.flagrans发酵液与普通营养菌丝发酵液进行了大规模蛋白质表达相对定量分析。结果,共鉴定出蛋白质258个,其中46个为显著差异表达蛋白质。进一步对差异蛋白质进行GO注释,结果表明,经线虫幼虫诱导的D.flagrans发酵液中差异蛋白参与的蛋白功能和生物学过程更加多样,以催化和结合功能为主,同时还参与感知环境刺激、信号转导、过氧化活性及胞壁合成等过程。进一步分析表明,与对照组相比,过氧化氢酶和三羧酸循环中柠檬酸甲酯合酶前体上调表达加快了有氧呼吸,推测D.flagrans分泌胞外蛋白酶还需要氧化应激。此外,丝氨酸酶与酪氨酸酶前体显著差异表达,可能该类酶是D.flagrans侵染线虫的重要毒力因子。KEGG代谢通路分析表明,差异蛋白还主要参与了糖、脂质和氨基酸等初级产物以及次级代谢物的合成与代谢过程。通过对差异蛋白质组的深入解析和研究,有利于揭示D.flagrans对线虫的作用机理,为应用D.flagrans对线虫生物防控提供了强有力的支撑。     

基于高通量测序的多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异circRNA的生物信息学分析

分析多房棘球蚴感染小鼠肝组织中差异表达的环状RNA(circRNA),探究circRNA在宿主感染过程中可能参与的调控作用。采用高通量circRNA芯片技术比较感染组和对照组小鼠肝组织circRNA表达谱的差异,利用生物信息学对差异circRNA亲本基因进行GO和KEGG富集分析。结果显示,上调表达的circRNA有201个,下调表达的circRNA有9个,差异表达共计210个,经实时荧光定量PCR验证出其中4个上调和2个下调差异circRNA的表达水平变化趋势与芯片结果相一致。GO富集分析显示,在分子功能、生物过程及细胞组分均有富集;KEGG富集通路则有内吞作用、SNARE蛋白相关囊泡运动、矿物质吸收等与免疫相关的信号通路。结果提示,感染多房棘球蚴的小鼠肝组织与对照组小鼠肝组织比较,circRNA表达谱发生了显著性变化,这些差异表达的circRNA及其潜在的靶分子可能与多房棘球蚴感染宿主早期免疫反应有关。     

羊口疮病毒ORFV129蛋白对树突状细胞成熟和功能的影响

为了探讨羊口疮病毒ORFV129蛋白对小鼠骨髓树突状细胞(DCs)生物免疫学功能的影响,从小鼠骨髓腔中分离获得单核细胞,诱导分化为未成熟DCs并用不同浓度的ORFV129蛋白进行刺激,采用流式细胞术检测成熟DCs的表面标记物MHC-Ⅱ、CD40等表达及吞噬FITC-dextran的能力,以及检测ORFV129蛋白作用DCs后分泌IFN-γ、IL-6等细胞因子的水平;采用CCK8法检测ORFV129蛋白对DCs刺激T细胞增殖的影响以及检测培养上清中IFN-γ、IL-5的水平。结果显示,经10μg与5μg浓度的ORFV129蛋白作用24 h后,DCs表面分子CD80、CD40的表达显著上调,与未处理组相比差异显著(P0.05);经ORFV129蛋白刺激后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降;10μg的ORFV129蛋白极显著地促进了IFN-γ、IL-6、IL-12p40等细胞因子的表达,与空白组相比差异极显著(P0.01);另外,经ORFV129蛋白处理的DCs还可刺激T细胞增殖,以及使培养上清中IFN-γ的分泌量显著增加。ORFV129蛋白可上调DCs表面MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86分子表达,降低其吞噬能力,促进DCs分泌IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12p40等细胞因子,还可刺激T细胞增殖,表明ORFV129蛋白对DCs的成熟起到促进作用。     

egr-miR-71过表达对绵羊PBMCs蛋白组的差异表达分析

为了探究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)来源的miR-71(egr-miR-71)对绵羊外周血单核细胞(PBMCs)蛋白组的影响。本研究使用密度梯度离心法分离得到绵羊PBMCs,并使用电穿孔法将egr-miR-71转染至绵羊PBMCs,用qPCR检测转染效率。基于iTRAQ方法,对比分析egr-miR-71过表达对绵羊PBMCs蛋白表达的影响,通过qPCR和Western-blotting对骨髓源性生长因子(MYDGF)转录水平和翻译水平进行验证。结果显示,绵羊PBMCs转染egr-miR-71模拟物后,miR-71的相对表达量极显著上调(P<0.01)。利用iTRAQ共鉴定出7642个蛋白质,其中157个呈差异表达,与对照组相比,68个蛋白显著上调,89个蛋白显著下调。下调的蛋白主要包括巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MYDGF、酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)和碳酸酐酶(CAs)等。这些差异蛋白主要参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、转化生长因子-β(TGF-β)等信号通路。qPCR和Western-blotting结果显示,与对照组相比,模拟物转染组中MYDGF转录和翻译水平均显著下调(P<0.05)。通过对转染egr-miR-71后绵羊PBMCs的蛋白进行组学分析,初步了解了egr-miR-71对绵羊PMBCs表达蛋白的调控,鉴定出的差异蛋白可能在细粒棘球蚴与宿主互作中发挥重要作用。这为深入研究细粒棘球绦虫的感染机制提供了思路,也为新型抗包虫病药物的研发提供了理论依据。     

长白猪γ-干扰素基因的原核表达与分析

以含长白猪IFN-γ基因的质粒载体为模板,用原核表达引物扩增了长白猪IFN-γ基因,将其定向克隆至原核表达载体pET28b的EcoRⅠ和XhoⅠ位点,构建了长白猪IFN-γ基因的原核表达载体pET28b-PoIFN-γ。经酶切、PCR鉴定,表明所构建的重组质粒为特异性长白猪IFN-γ基因原核表达质粒。将该重组质粒转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)细胞,阳性菌落筛选、SDS-PAGE分析以及Western-blotting分析表明,成功构建了表达重组猪IFN-γ的大肠埃希氏菌基因工程菌株。亚细胞定位分析表明,目的蛋白经原核表达后主要以不溶性包涵体形式存在,其他少量可溶性目的蛋白存在于细胞浆中。     

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。     

鸭疫里默氏杆菌血清1型和2型的比较蛋白质组分析

应用双向电泳和质谱技术对鸭疫里默氏杆菌(RA)血清1型和2型的菌体蛋白进行了比较蛋白质组学研究,分析了血清1型和2型鸭疫里默氏杆菌的菌体蛋白表达特点,研究了差异表达蛋白与血清型及细菌毒力的关系。结果显示,质谱分析鉴定出17个差异蛋白,代表11种蛋白质,其中有7个是RA的外膜蛋白,5个是酶类,3个是热休克蛋白家族,另外2个蛋白参与蛋白质的合成过程。推测它们可能与RA的血清型及毒力密切相关。     

恒河猴干扰素-γ基因的原核表达及其免疫活性的初步研究

为构建以恒河猴干扰素-γ为目的基因的原核表达重组质粒并进行免疫活性分析,获得具有生物学活性重组IFN-γ蛋白。应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从恒河猴外周血单个核细胞(PBM C)扩增干扰素-γ基因,然后将其克隆至表达载体p ET32a(+)中,转化BL21(D E3)进行诱导表达。SDS-PAG E电泳分析其可溶性,W estern-blot检测纯化后的重组蛋白,采用淋巴细胞增殖试验检测重组IFN-γ的活性。结果显示,成功构建恒河猴干扰素-γ原核表达重组菌,重组蛋白分子质量约为35.4 ku,主要以包涵体形式存在。重组IFN-γ具有促进淋巴细胞转化增殖的生物学活性。结果表明,本试验成功获得了重组IFN-γ蛋白,表达量高且具有生物学活性,为重组IFN-γ治疗恒河猴疾病奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK和鸡IFN-γ重组质粒的构建与体外表达

采用SOE-PCR技术将鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK抗原基因与鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因用(GGGGS)315个疏水柔性氨基酸接头融合,扩增出IFN-γ-CDPK融合基因,将其克隆到pMAL-p2X载体上,构建了重组原核表达质粒pMAL-IFN-γ-CDPK,用IPTG诱导表达并纯化重组蛋白,经免疫印迹分析该蛋白的生物学活性。结果显示,成功构建了共表达IFN-γ-CDPK融合基因的原核表达载体,表达纯化了具有良好的免疫反应性的IFN-γ-CDPK融合蛋白,表达纯化的IFN-γ-CDPK融合蛋白能够和鸡柔嫩艾美耳球虫甘肃株抗血清发生特异性结合,为进一步研制高效力的鸡球虫新型基因工程疫苗奠定了基础。     

CBS和CSE在成年牦牛子宫中的表达及定位

胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)通过与胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)共同作用生成内源性硫化氢(H₂S),参与硫氨基酸代谢来调控细胞的生长、增殖、凋亡等正常生理功能。为了解CBS和CSE在成年牦牛子宫中的作用,分别采集妊娠期、黄体期、卵泡期牦牛子宫组织样品,通过qRT-PCR、Western-blot和免疫组织化学等方法检测CBS和CSE基因及其蛋白的相对表达情况。结果显示,CBS mRNA在黄体期牦牛子宫组织中表达量显著高于妊娠期和卵泡期(P<0.05),且妊娠期的表达量显著高于卵泡期(P<0.05);CSE mRNA在妊娠期的表达量最高(P<0.05),黄体期和卵泡期的表达差异性不显著(P>0.05)。CBS蛋白在卵泡期的表达量最高(P<0.05),黄体期和妊娠期的表达差异量不显著(P>0.05);CSE蛋白在卵泡期牦牛子宫组织中表达量显著高于妊娠期和黄体期(P<0.05),且黄体期的表达量显著高于妊娠期(P<0.05)。免疫组织化...     

鸡IFN-γ单克隆抗体的制备及其识别区的鉴定

IFN-γ是鸡体内一种重要的细胞因子,为制备鸡IFN-γ的单克隆抗体,以ch IFN-γ-His融合蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后分离出脾细胞与骨髓瘤细胞系(SP2/0)进行融合,经单克隆培养,筛选得到4株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2A10、2B10、4D10和4F9。应用间接ELISA方法鉴定4株单抗的重链类型分别为IgG2a、IgG1、IgG1和IgG2b。通过间接ELISA方法测定4株单抗的亲和力解离常数(Kd)分别为1.06×10~(-10)、7.35×10`(-10)、1.10×10~(-10)和9.34×10~(-10),表明4株单抗均为高亲和力抗体。将ch IFN-γ的C端、N端同时进行表达,应用Western-blot方法鉴定4株单抗的抗原识别表位分别为chIFN-γ的47-100位氨基酸,101-145位氨基酸和1-46位氨基酸。应用Western-blot方法鉴定4株单抗的特异性,4株单抗均能识别原核表达的重组蛋白chIFN-γ,而不识别鸡ch IL-2、ch IL-4、ch IL-10蛋白,表明4株单抗特异性良好。原核表达chIFN-γ蛋白制备单克隆抗体效果良好,为进一步研究chIFN-γ的功能奠定了基础。     

旋毛虫ES抗原致小鼠骨髓源树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响

为探讨旋毛虫排泄分泌(ES)抗原体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC2.4)在不同时间点对吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达情况,将ES抗原(终浓度为15?g/mL,试验组)、重组小鼠IFN-γ(浓度为1 000 U/mL,阳性对照组)和RPMI 1640培养液(阴性对照组)加入到状态良好的树突状细胞中,并设无添加的空白对照组,分别刺激0、2、6、12、24 h后收集细胞,采用细胞免疫组织化学方法检测各组树突状细胞IDO的表达情况,实时荧光定量法检测各组IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αmRNA表达水平,W estern-blot方法检测各组IDO蛋白表达水平。结果显示,ES抗原、IFN-γ均能提高IDO在细胞质中的mRNA及蛋白表达水平,且与空白对照组呈显著性差异(*P0.05,*P0.01,***P0.001);随着刺激时间的增加,IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αm RNA及IDO蛋白表达量均显著上升,且与空白对照组呈显著性差异(***P0.001)。结果证实,ES抗原可刺激树突状细胞表达IDO,且存在一定的时间效应,可能与旋毛虫逃避宿主的免疫有一定关系。     

牦牛IFN-γ基因的表达及其产物的生物学活性分析

用植物血凝素和脂多糖诱导牦牛外周血淋巴细胞,提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆了牦牛IFN-γ(YakIFN-γ)基因,然后设计了1对表达引物,从pGEM-YakIFN-γ载体上扩增YakIFN-γ成熟蛋白基因,将牦牛IFN-γ基因与表达载体pET-30a连接,构建了重组表达质粒pET-30-YakIFN-γ。用IPTG诱导表达的可溶性表达产物经镍柱亲和纯化,用纯化的重组YakIFN-γ蛋白进行了MTT、抑制肿瘤细胞增殖和细胞病变抑制的生物学特性研究。结果显示,成功克隆和表达了YakIFN-γ基因;序列分析表明:克隆的YakIFN-γ基因序列与GenBank上登录的黄牛IFN-γ基因序列的同源性为99.0%。SDS-PAGE分析和Western-blot检测证实,获得了高纯度的重组YakIFN-γ蛋白。重组YakIFN-γ(rYakIFN-γ)对伪狂犬病病毒的活性单位为2.2×103U/mg。表明表达并纯化的rYakIFN-γ蛋白具有较高的生物学活性和干扰病毒复制的活性。     

扬子鳄α型干扰素基因的克隆分析及表达量的测定

为研究扬子鳄IFN-α基因的序列、结构及生物学功能,对其进行了基因克隆、序列分析及表达量的测定。根据GenBank中登录的扬子鳄IFN-α基因序列(XM_006026085.1)设计合成特异性引物,通过RTPCR从成年扬子鳄外周血中扩增及克隆IFN-α基因CDS区,对其进行测序分析、进化树构建、同源性分析及结构和功能预测,并对扬子鳄不同组织中IFN-α的表达水平进行测定和分析。结果显示,扬子鳄IFN-α基因的完整ORF序列为672 bp,编码氨基酸223个,其中前26个氨基酸为信号肽。成熟蛋白的分子质量为26ku,等电点为9.51。三级结构预测显示该蛋白含有5段α螺旋,符合I型干扰素结构特征。同源性和进化树分析结果显示,扬子鳄IFN-α基因与密西西比鳄的同源性最高,在进化树中处于同一分支。IFN-α表达量在血液中最高,肌肉组织中表达量最低,非冬眠期的表达量高于冬眠期的表达量。上述研究结果为进一步研究扬子鳄IFN-α基因表达调控机制和基因功能奠定了基础。     

HSP27慢病毒载体的构建及其稳定表达细胞株的建立

热休克蛋白27(HSP27)是一种结构上高度保守的小分子热休克应激蛋白,它可通过与细胞自噬、细胞凋亡和天然免疫信号通路关键因子相互结合参与多种病毒的感染过程。为了便于深入研究HSP27在机体抗感染免疫中的作用,用PCR方法从A549细胞中扩增出HSP27片段,然后经双酶切、连接、转化等步骤获得HSP27的慢病毒表达载体pTRIP-HSP27,将此载体和另一对照载体pTRIP-EGFP分别转染至HEK-293T细胞中,48 h后收集慢病毒将其转导至A549细胞,经嘌呤霉素筛选获得过表达HSP27的细胞株A549-HSP27和过表达EGFP的对照细胞株A549-EGFP。最后,经RT-qPCR、Western-blottin、gIFA和细胞活力检测等方法进行鉴定,获得了能稳定表达HSP27的细胞株。     

鸡IFN-γ基因的原核表达及其表达产物的抗NDV活性

设计了1对特异性引物,从含有广西三黄鸡IFN-γ基因的重组质粒pMD18-ChIFN-γ中扩增出鸡的IFN-γ基因,将该基因插入到原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达质粒pGEX-ChIFN-γ,并将其转入到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot分析,其分子质量约为42.4 ku,表明鸡IFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。采用NDV国内参考强毒株F48E9对复性后的IFN-γ进行了活性测定;结果显示,IFN-γ的抗病毒活性为1.33×104U/mL。     

绵羊卵母细胞的差异蛋白质组学研究

为了研究绵羊卵母细胞成熟过程中蛋白质的表达模式,以期在蛋白质水平探索绵羊卵母细胞成熟的分子机制,将采用双向凝胶电泳技术获得的2-DE图谱经PDQuest8.0分析并找出差异蛋白斑点后,对差异蛋白斑点进行高效液相色谱串联离子阱质谱分析。结果显示,GV期和MⅡ期卵母细胞2-DE图谱之间存在13个表达差异明显的蛋白斑点;4个蛋白斑点的质谱检测结果较为理想,对应3种不同的蛋白质,分别为截短的VP2、苹果酸脱氢酶、谷胱甘肽转移酶M3;其中截短的VP2、苹果酸脱氢酶在卵母细胞成熟过程中表达量下调,谷胱甘肽转移酶M3在卵母细胞中大量表达并且表达量上调。结果表明,绵羊卵母细胞成熟过程中,细胞的mRNA合成和表达水平以及糖代谢水平可能降低,细胞的抗氧化和解毒能力可能提高。     

川楝素对早期妊娠小鼠的毒性作用及对Th1型细胞因子含量的影响

为研究Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α在流产发生机制中的意义,探讨中药单体成分川楝素的致流产作用及机理,给妊娠第5天的小鼠连续3d腹腔注射不同剂量的川楝素溶液,对照组以等量的100mL/L丙二醇生理盐水代替,于妊娠第8天剖杀,用ELISA方法检测血清和子宫组织中IFN-γ和TNF-α的水平。结果显示,川楝素的致流产作用呈剂量依赖性,随着注射剂量的增加,小鼠的流产率逐渐上升。随着注射剂量的增加,小鼠血清和子宫组织中IFN-γ、TNF-α的表达水平显著升高,与对照组差异显著(P<0.05或P<0.01)。结果表明,川楝素诱导孕鼠流产与Th1型细胞因子IFN-γ、TNF-α含量的增加有密切关系。