宿主Arf6通过阻止口蹄疫病毒入侵发挥抗病毒作用

本实验室前期i TRAQ技术研究发现母猪初乳中Arf6表达量显著高于常乳,现有文献报道Arf6在病原感染中扮演重要角色。为研究宿主Arf6在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,本研究构建Arf6真核表达质粒,应用Arf6抑制剂,利用RT-qPCR和Western-blot技术检测FMDV和Arf6的相互调控作用;构建Arf6系列突变体,评估Arf6调控FMDV复制的功能区或者功能位点;利用间接免疫荧光技术(IFA)分析Arf6对FMDV入侵的影响。结果表明,FMDV感染PK-15细胞后,内源性Arf6表达水平显著上调;过表达Arf6抑制FMDV在PK-15细胞中的复制;抑制Arf6能促进FMDV复制;Arf6(155-176 aa)不是Arf6抑制FMDV侵入的关键区域,第48位氨基酸是Arf6抑制FMDV入侵的关键位点。IFA结果显示,Arf6在细胞膜水平阻止了FMDV的入侵。结果表明,宿主Arf6在FMDV入侵层面发挥了抗病毒作用,本研究结果为揭示FMDV和宿主蛋白相互调控作用提供了理论依据。     

CD44受体分子对口蹄疫病毒感染的影响

为探索CD44分子在口蹄疫病毒(FMDV)感染中的作用,揭示FMDV的感染机制,为开发阻断FMDV入侵的药物和高效疫苗提供新靶点。采用Western-blot、TCID50检测、激光共聚焦显微镜检测等方法,检测FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达水平,以及用抑制剂MβCD抑制CD44表达后对FMDV增殖的影响。Western-blot结果显示,FMDV感染BHK21细胞后,CD44的表达量显著上升(P0.05);用MβCD抑制内源性CD44表达后,FMDV的增殖水平显著降低(P0.05)。TCID50检测结果显示,用MβCD抑制CD44表达后,FMDV的表达显著降低(P0.05)。激光共聚焦结果显示,FMDV感染BHK21细胞后CD44的表达量上升。表明,CD44分子参与FMDV的感染过程,可能作为调控分子直接或间接参与FMDV的入侵过程,仍需要进一步研究。     

扬子鳄α型干扰素蛋白抗病毒活性分析

为了研究扬子鳄IFN-α抗病毒活性,构建真核表达载体pcDNA3.1-caIFN及pEGFP-N1-caIFN,将pc DNA3.1-caIFN转染至293T细胞中,通过间接免疫荧光试验证明IFN-α成功表达,并显示定位于细胞质中,第48小时扬子鳄IFN-α的表达量要高于第24小时的。将pEGFP-N1-caIFN转染至Vero细胞中,过表达24 h后接种水疱性口炎病毒(VSV),观察细胞,并在VSV感染后第24及48小时收集细胞,通过荧光定量PCR测定病毒VSV-G基因的变化,同时收集上清测定VSV子代病毒滴度,结果表明,与对照组相比,第24及48小时过表达扬子鳄IFN-α的试验组VSV-G基因的表达分别下调4倍及7倍,VSV子代病毒滴度分别低2.3及1.9个数量级。本研究结果证明,真核表达扬子鳄IFN-α蛋白能够抑制VSV mRNA的转录,并能抑制病毒增殖。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对猪肺泡巨噬细胞产生Ⅰ型干扰素mRNA转录水平的影响

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)体外感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)对其产生Ⅰ型干扰素mRNA转录水平的影响,从猪繁殖与呼吸综合征阴性的健康仔猪肺中分离和培养PAMs,随机将其分为正常对照组、PRRSV感染组和poly(I:C)处理组。于感染后第12、24、36、48、60小时分别收集细胞,运用半定量RT-PCR法检测PAMs产生Ⅰ型干扰素的mRNA转录情况。结果显示,与正常对照组和poly(I:C)处理组相比,PRRSV感染组中IFN-α/βmRNA转录水平在各时间段均显著下调。其中,PRRSV感染组中IFN-αmRNA的转录在感染后第12~36小时呈先升高后降低的趋势,在第48小时有所上调,但在感染后第60小时IFN-αmRNA的转录显著下调;而IFN-βmRNA的转录在感染后第12~24小时基本没有变化,在第36小时最低,在感染后第48小时有所上调,但在感染后第60小时IFN-βmRNA的转录显著下调。结果表明,PRRSV可导致PAMs产生Ⅰ型干扰素的mRNA转录水平降低,从而使宿主细胞及机体非特异性免疫功能受到抑制。     

重组牛IFN-α对亚洲Ⅰ型口蹄疫亚单位疫苗免疫小鼠的影响

在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达了牛IFN-α基因、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)VP1和VP1 C末端基因,并纯化了所表达的蛋白。用透析的方法进行蛋白复性后制成油乳剂疫苗,经皮下多点注射免疫小鼠,以MTT法检测小鼠脾淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后的增殖反应活性;以液相阻断ELISA检测血清FMDV特异抗体的变化。结果表明,重组VP1(rVP1)和rVP1 C末端蛋白能单独诱发小鼠的体液免疫反应和微量的细胞免疫反应,而与重组牛IFN-α(rBoIFN-α)共同接种的小鼠,体液免疫反应和细胞免疫反应更为明显。     

禽呼肠孤病毒σA基因对鸡胚成纤维细胞天然免疫相关基因转录水平的调控影响

为了明确禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σA基因对宿主天然免疫应答的影响,本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞(DF1)后,不同时间点(转染后第3、6、12、24和36小时)DF1细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、MAVS、My D88、TRIF、IRF-3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果,与空载体转染细胞相比,pCAGEN-σA转染细胞中上述这些天然免疫基因的m RNA水平出现不同程度变化(P0.05或P0.01)。TLR3应对最快速,其m RNA水平在转染后第3小时和第6小时迅速上升,但9 h后逐渐下降;MDA5和TLR7的m RNA水平,则分别在转染后第6小时和第12小时开始显著升高,并分别在转染后第12小时和第36小时达到峰值(P0.05或P0.01);TLR15的m RNA水平整体变化不明显。My D88和MAVS的m RNA水平呈表达上调趋势;TRIF在转染后第6小时表达量迅速达到峰值(2.83倍),随后急速下降。NF-κB呈表达上调趋势;而IRF3/7的表达则被抑制。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)呈现相似的表达模式,在转染后第6小时和第24小时表达量增加,其他时间点均为表达量下降; IL-6和IL-8则表达上调,分别在转染后第9小时和第6小时达到峰值(P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的m RNA水平也显著升高,均在转染后第12小时达到峰值(P0.01)。上述试验结果表明,在DF-1细胞中过表达σA基因,能显著引起天然免疫相关基因的表达的变化,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机理奠定了基础。     

食淀粉乳杆菌对轮状病毒受体GM3及其合成酶mRNA的影响

为探讨食淀粉乳杆菌抗猪轮状病毒的可能机制,选择3日龄清洁级中国昆明鼠乳鼠为实验动物,每天灌喂食淀粉乳杆菌,在饲喂后第4天接种轮状病毒,应用ELISA定量检测猪轮状病毒的主要受体之一神经节苷酯(Ganglioside)GM3,并采用实时荧光定量PCR技术测定各样本中葡萄糖神经酰胺糖基转移酶(UGCG)、ST3-半乳糖苷α-2,3唾液酸转移酶5(St3gal5)的mRNA相对含量。结果显示,饲喂后第5、9及11天,食淀粉组神经节苷酯GM3含量显著高于正常组及攻毒组(P0.05),第5、7、9及11天时食淀粉组Mus St3gal5 mRNA相对表达量均显著低于正常组(P0.05),第7、9及11天时食淀粉组Mus St3gal5 mRNA相对表达量显著低于攻毒组(P0.05),第7、9及11天时食淀粉组Mus UGCG mRNA相对表达量均显著低于正常组及攻毒组(P0.05)。结果表明,乳鼠感染轮状病毒后,食淀粉乳杆菌能够显著促进小鼠空肠中神经节苷酯GM3的合成,并显著抑制小鼠空肠中Mus St3gal5 mRNA及Mus UGCG mRNA的表达。本研究为进一步研究食淀粉乳杆菌抗轮状病毒机理提供了帮助。     

负载灭活口蹄疫病毒树突状细胞活化CD8+T细胞的非蛋白酶体依赖途径

为研究树突状细胞加工和呈递灭活口蹄疫病毒(FMDV)抗原并活化CD8+T细胞的途径,用灭活FMDV负载经抑制剂预处理的小鼠单核细胞源树突状细胞(MoDCs),与CD8+T细胞共培养,对照为负载FMDV的正常MoDCs与CD8+T细胞.收集上清液,检测γ干扰素(IFN-γ)的含量.结果显示,试验组CD8+T细胞在共培养的...     

口蹄疫病毒持续感染研究概述

(一)口蹄疫病毒(FMDV)持续感染的特性1.生物学特性:体内和体外模型研究表明:在有抗体存在时,FMDV可持续感染,并发生演化(Youn-gner,1980;Gebauer and Torre,1988;Torre等,1988),演化后的病毒有不同于原来病毒的特性(Burrows,1966;Hyslop,1965;Sobinro等,1983;Torre等,1985)。从持续感染FMDV牛体内和体外培养的细胞上分离的病毒,在正常细胞上产生蚀斑的大小与原病毒的相比有减小的趋势(Seibold,1964;Straver等1970,1972;Torre等,1985)。但各型病毒在持续感染的不同时期其蚀斑大小变化不尽一致。通过冻融和     

食淀粉乳杆菌对猪A群轮状病毒NSP4在小鼠肠组织表达的影响

为探究食淀粉乳杆菌对猪轮状病毒(PRV)非结构蛋白NSP4表达的影响,对3日龄清洁级BALB/c小鼠分别在感染PRV前后灌服食淀粉乳杆菌,应用实时荧光定量PCR检测感染病毒后空肠组织中PRVNSP4的m RNA相对表达量,采用比色法测定空肠组织内钙离子含量变化,并通过ELISA定量检测空肠组织中整联蛋白α2β1、磷脂酶C和Dicer的含量。结果显示,饲喂食淀粉乳杆菌第5天和第7天时,预防组和辅疗组中NSP4的m RNA相对表达量显著低于病毒组(P0.05);除预防组第11天外,感染病毒后各检测时间点预防组和辅疗组的钙离子含量显著低于病毒组(P0.05);饲喂食淀粉乳杆菌第7天、第9天和第11天时,预防组和辅疗组中整联蛋白α2β1的含量显著低于病毒组(P0.05);感染病毒后各检测时间点预防组和辅疗组中磷脂酶C和Dicer的含量均低于病毒组。以上结果表明:在小鼠感染轮状病毒前后灌服食淀粉乳杆菌均能显著抑制PRV NSP4的m RNA表达和整联蛋白α2β1的合成,并降低空肠组织中钙离子,磷脂酶C和Dicer的含量,这为研究益生菌抗轮状病毒机制提供参考。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术,扩增出口蹄疫病毒(FMDV)VP2基因,并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞,获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后,感染sf9细胞,表达VP2融合蛋白,分子质量为33 ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体,通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定,说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达,且可以与牛抗O型FMDV血清发生特异性反应。     

用紫外分光光度计检测口蹄疫病毒的研究

用紫外分光光度计测试口蹄疫病毒(FMDV)含量中,比较研究了PBS、Tris、含不同浓度蔗糖液和不同浓度迭氮钠液的差异性、相关性、直线回归方程及不同置信度下的方程误差.结果表明,蔗糖浓度与FMDV的吸光度值之间有显著直线负相关,以PBS和Tris为对照检测FMDV,对检测结果的不利影响甚微;在FMDV中加迭氮钠的最大量不能大于5.4 mg/L,否则无法测定FMDV的吸光度值;检测蔗糖密度梯度离心纯化的FMDV抗原,必须以相应级份的蔗糖液为对照才能准确定量.     

山羊IFN-γ和TNF-α基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中山羊γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因。将IFN-γ、TNF-α基因克隆至p MD-19-T载体,得到各自阳性克隆质粒,以2种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。应用所建立的方法检测刀豆蛋白A(Con A)刺激健康山羊外周血单核细胞(PBMC)后不同时间点IFN-γ、TNF-α基因转录量。结果表明,当质粒标准品稀释度为1×10~9copies/L~1×10~5copies/L时,扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.999和1.000;熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。IFN-γ在第2小时和第48小时这两个时间点出现mRNA转录高峰,在第2小时检测到IFN-γ转录量为1.26×10~5copies/L,第48小时检测到转录量为8.56×10~4copies/L;TNF-α在0~24 h呈现下调的表达趋势,第48小时出现mRNA转录高峰,转录量为2.73×10~5copies/L;研究结果将为IFN-γ、TNF-α的定量分析提供技术平台。     

口蹄疫病毒P1 2A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建

以A型口蹄疫病毒(FMDV)AV88(L)和XJ99株的P12X基因和AV88(L)3C基因的阳性克隆质粒为模板,用PCR扩增各基因片段,酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明,获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88(L)P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C,为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。     

细胞自噬相关蛋白ATG9A对口蹄疫病毒侵入的影响

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒（FMDV）复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMDV吸附、内化、基因组复制、蛋白翻译、子代病毒粒子产生的影响。结果显示,FMDV感染后与ATG9A共定位且抑制ATG9A的表达;ATG9A不影响FMDV的吸附,但极显著地抑制FMDV的内化过程;同时,过表达（或干扰）ATG9A能够在RNA与蛋白水平显著降低（或提高）FMDV的增殖和子代病毒粒子产生的能力。结论,ATG9A抑制FMDV的复制,为深入认识FMDV在细胞内的复制周期提供了线索。     

NSP-ELISA鉴别FMDV感染与免疫

利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒 (FMDV)非结构蛋白 (NSP) 3ABC多肽作为抗原 ,建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验 (I ELISA)。通过对 336份正常牛血清、50 8份注射疫苗牛血清、60份人工感染牛血清和 58份豚鼠免疫血清的检测 ,确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。试验证明 ,该方法简易、快速 ,灵敏度比VIAA AGID高     

趋化因子配体5及趋化因子受体5在人工感染多杀性巴氏杆菌的鸡脾内的动态表达

给20日龄伊莎褐蛋鸡皮下注射多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)建立了禽霍乱动物模型,以感染后第4、12、24、48、120小时为时间点采样,运用病理学技术和免疫组织化学方法,研究被感染鸡的肝、脾病理学变化及脾内趋化因子配体(CCL5)及趋化因子受体5(CCR5)的动态表达。结果显示,雏鸡感染多杀性巴氏杆菌后发现明显局灶性肝坏死和脾内淋巴细胞减少,脾内CCL5和CCR5的表达量在感染后第48小时明显上升,尤其是感染后第24小时表达量最高,均明显高于对照组(P0.05),且与病变严重程度呈正相关。感染后第120小时趋于正常。结果表明,多杀性巴氏杆菌可以刺激蛋鸡脾内CCL5和CCR5表达的一过性上调,这种反应在禽霍乱鸡的肝、脾损伤过程中可能发挥重要的生物学作用。     

食淀粉乳杆菌对猪轮状病毒感染中NSP1及IκB/NF-κB通路mRNA表达的影响

为探究食淀粉乳杆菌对轮状病毒感染中NSP1及NF-κB通路mRNA表达的影响,将食淀粉乳杆菌及其分泌上清分别作用于轮状病毒感染的乳鼠和IPEC-J2细胞,采用荧光定量PCR技术测定各组NSP1和IκB/NF-κB通路的mRNA水平变化。体内与体外试验结果显示,食淀粉乳杆菌及其分泌上清可显著下调NSP1 mRNA的表达(P0.05)。体外试验中,预防性干预组(BI组)IκB、NF-κB整体趋势相似,与正常对照组相比NF-κB mRNA上调显著(P0.05),与轮状病毒组(RV组)和治疗性干预组(AI组)相比表达相对平稳,IκB mRNA在第4到6小时上调显著(P0.05);体内试验中,在乳鼠感染轮状病毒的3 d内BI组NF-κB mRNA显著上调且与RV组和AI组差异显著(P0.05);第3天时BI组IκB mRNA水平上调高于RV组和AI组且差异显著(P0.05),RV组和AI组无显著性差异(P0.05)。结果表明,食淀粉乳杆菌及其分泌上清能够有效下调猪轮状病毒NSP1的mRNA表达,在激活IκB/NF-κB通路、提高机体先天性免疫方面具有积极作用,而且预防作用优于治疗作用。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体 pBAD/TOPO中 ,经鉴定后得到了重组质粒 pBAD VP1。将此重组质粒转化到受体菌TOP10中 ,分别以不同浓度的诱导剂L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS PAGE和蛋白质印迹分析。结果 ,以终浓度为 0 .0 2 g/L的L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,4h后表达可达到高峰 ,表达产物大小约为 4 0ku。软件扫描结果显示 ,VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的 2 6 .3% ,能与抗FMDV抗体发生特异性反应 ,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体 ,经过洗涤后制成油乳剂疫苗 ,经皮下注射免疫豚鼠 ,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数 ,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明 ,用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体 ,并对病毒的攻击提供免疫保护。