表达水泡性口炎病毒G蛋白的重组腺病毒的构建与鉴定

为了以复制缺陷型人5型腺病毒为表达载体,构建表达水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IN)G蛋白的重组腺病毒,利用PCR扩增编码VSV-IN G蛋白的基因,并将其克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中;再将含有目的基因的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体质粒用PacⅠ酶切线性化后共转染AAV-293细胞,获得重组腺病毒rAd-VSV-IN-G。该重组腺病毒于AAV-293细胞连续传代至第20代效价稳定。间接免疫荧光试验和Western-blot检测结果显示,G蛋白在重组腺病毒中可以被正确表达。上述研究成果为VSV重组腺病毒疫苗的研制奠定了基础。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因,继而构建出真核表达载体pVAX-VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上,筛选出VP1表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子,获得转移载体。再经酶切,连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞,转染3次后,细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定,证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2/FMDV。经验证,该重组毒可稳定遗传,其毒价为103.5TCID50/mL。     

猪传染性胃肠炎病毒聚合酶基因反义RNA对病毒的抑制作用

通过PCR扩增出猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)聚合酶部分片段,反向插入逆转录病毒表达载体pLXSN中,用脂质体法将重组质粒plxas-pol转染PA317细胞,经抗生素G418筛选出稳定的产毒细胞克隆,分别扩大培养后,取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,细胞克隆产生的重组病毒效价达9.0×105CFU/mL。用高效价假病毒感染IBRS2细胞,再经抗生素G418筛选,提取细胞克隆总RNA,经RT-PCR证明plxas-pol整合入IBRS2细胞。以TGEV感染IBRS2细胞和具有抗性的IBRS2细胞所产生的细胞病变为指标,证明该反义RNA对病毒有明显抑制作用,抑制率约为80%。用2×103和4×102TCID50/mL剂量的TGEV感染时,引起细胞死亡的时间分别为21 h和27 h,与对照组相比,抗性细胞系可明显延迟因病毒感染引起细胞死亡的时间。     

同一份组培细胞繁殖(复制)两种病毒的研究

用同一份仔猪肾组培细胞先繁殖猪瘟病毒(中国猪瘟兔化弱毒),再繁殖口蹄疫O型病毒,猪瘟组培细胞毒兔检可达5 ×10~4ID/1毫升。O型口蹄疫细胞毒鼠测毒价可高达≥10~(8·5)“MLD_50/0.1毫升。 被猪瘟病毒感染后的细胞不发生细胞病变(cpe),大量繁殖猪瘟病毒后的细胞(即3～5次收毒后的细胞),再感染口蹄疫O型病毒,细胞病变率几乎达100％。从而说明猪瘟病毒与口蹄疫O型病毒是可以先后在同一份细胞内复制的。     

二甲双胍对水疱性口炎病毒的抑制作用及其机制的初步研究

为探讨二甲双胍（Metformin）对水疱性口炎病毒（VSV）复制的影响及其作用机制,笔者利用CCK-8法检测不同浓度Metformin对PK-15细胞活力的影响,同时利用RT-qPCR、Western-blot等技术分析Metformin对病毒复制、细胞因子表达及其作用途径的影响。结果显示,当Metformin的浓度达到10 mmol/L时,细胞的存活率仍接近100%。与未处理的感染细胞组相比,Metformin显著抑制VSV在PK-15细胞和Vero细胞中的复制。进一步的研究发现,Metformin通过激活AMPK、抑制m TOR进而诱导自噬,同时抑制IFN-β、IL-6和TNF-α的表达;敲低自噬关键基因ATG7抑制VSV的复制,并促进IFN-β表达。本研究证实Metformin抑制VSV复制,丰富了Metformin影响病毒复制的网络信号,为病毒病有效防控提供重要的科学依据。     

口蹄疫病毒A型SAP突变毒株的构建及其生物学特性的测定

为了获得对牛和猪低致病性或无致病性的口蹄疫(FMD)疫苗毒株,提高疫苗毒株的生物安全性,选择口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白酶编码基因SAP区域进行突变。利用反向遗传操作技术,构建FMDV SAP区域突变的A型病毒重组质粒prA-SAP-FMDV。利用脂质体将构建的重组质粒转染BHK21细胞,重组质粒能够致细胞病变(CPE)。连续传代后,经RT-PCR鉴定和间接免疫荧光试验等,SAP突变的重组病毒rA-SAP-FMDV被成功拯救。另外,比较测定了该重组毒与亲本毒rA-WT-FMDV对BHK21细胞和乳鼠的致病性;结果显示,rA-SAP-FMDV的TCID50/mL为10-7.17,LD50为10-6.5/0.2mL,与亲本毒株的生物学特性相似。这一突变SAP域的A型FMDV的获得为研发生物安全性高的A型FMD疫苗奠定了基础。     

gga-miR-9*对传染性法氏囊病病毒复制的影响

为研究gga-miR-9*对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,采用化学合成的方法合成ggamiR-9*模拟物,然后用其转染DF-1细胞,接种IBDV,分别收集上清液和细胞,测定IBDV的效价和干扰素(IFN)含量;进一步用生物信息学方法预测gga-miR-9*的靶基因,并分别用双荧光素酶报告系统、Western-blot、qRT-PCR和RNA干扰对其靶基因进行验证。结果显示,gga-miR-9*模拟物能够促进IBDV的复制,抑制IFN的产生;gga-miR-9*可靶向降解IRF2mRNA和抑制IRF2蛋白的翻译;IRF2被敲除的DF-1细胞感染IBDV后的复制效价(106.25 TCID50/0.1mL)高于miRNA阴性对照组的效价(105.25 TCID50/0.1mL)。结果表明,细胞gga-miR-9*促进IBDV复制的分子作用机理是在IRF2基因转录后水平上抑制细胞天然免疫功能而发生的。     

慢病毒载体介导的西尼罗河病毒prME蛋白的表达

将西尼罗河病毒(WNV)的主要免疫原性基因prME插入HIV-1慢病毒载体pHR中,构建了转移质粒pHR-WNV/prME。在脂质体介导下,将该质粒与p△8.2、pVSV/G共转染293T细胞,48h后收获细胞上清。将上清转导正常的293T细胞,通过报告基因荧光观察、间接免疫荧光检测。结果表明,利用HIV-1慢病毒载体系统包装得到了假型病毒,可以高效转导293T细胞,并实现了WNVprME基因在被转导细胞中的表达,从而为基于慢病毒载体的WNV新型疫苗的研制奠定基础。     

表达流行毒株VP2蛋白的IBDV重组疫苗株rGtHLJVP2的构建及其免疫效力的评价

为应对传染性法氏囊病病毒(IBDV)变异毒株及超强毒株(vvIBDV)等突发疫情的出现,解决传统疫苗株筛选费时费力的难题,在流行病学调查的基础上,克隆了超强毒株HLJ0504的VP2基因,并突变细胞嗜性决定氨基酸位点(Q253H/A284T),用其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段,成功获得1株表达流行vvIBDV VP2蛋白的重组病毒rGtHLJVP2。体内、外复制动力学研究表明,该重组病毒与亲本病毒Gt的复制能力相当。动物试验结果表明,该重组病毒对接种鸡无明显致病性,接种鸡法氏囊指数均在0.7以上,法氏囊无明显萎缩现象。该重组病毒可以诱导机体产生良好的免疫应答,其抗体水平明显高于亲本毒,能够完全抵抗vvIBDV的攻击。另外,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。本研究结果为新型传染性法氏囊病疫苗的研发奠定了基础,对于IBDV突发疫情的应急防控具有重要意义。     

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法,用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317,经G418筛选,获得数个稳定的产毒细胞克隆,择优挑选7个细胞克隆扩增培养,收集细胞上清,用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA,进行逆转录套式PCR,检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价,同时用传统方法(小鼠成纤维放大法)进行测定。2种方法检测结果的比较表明,逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法,是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。     

金丝桃素的体外抗口蹄疫病毒活性

将体外培养的BHK21细胞感染FMDV后加入金丝桃素,日光灯下光活化1 h,通过细胞病变观察、MTT法、透射电子显微镜观察、H3 UR掺入试验,探讨了光活化金丝桃素对FMDV体外生长增殖的影响。结果表明,金丝桃素有明显的抑制FMDV致BHK21 细胞病变效应,能抑制FMDV的增殖,抑制率可达61.82%。透射电镜观察,金丝桃素组与病毒对照组相比,BHK21细胞的FMDV颗粒明显减少。证实,金丝桃素在体外有明显的抑制FMDV增殖的作用。     

超声作用对绵羊胎儿成纤维细胞转染效率的影响

为研究超声波对经脂质体介导的绵羊胎儿成纤维(sheep fetal fibroblasts,SFF)细胞转染效率的影响,用不同频率的超声波在不同时间内辐射经脂质体介导的SFF细胞,转染48h后收集细胞,用RT-PCR检测目的基因,台盼蓝染色检测细胞活性。转染后用G418挑选转基因单克隆细胞,计算转染率。结果显示,对细胞、质粒和脂质体的混合液共同超声辐射(时间60s,超声频率为2.5MHz)后转染,转染率要明显高于未超声辐射的细胞和先转染后超声辐射的细胞,并且细胞的存活率较高。结果表明,超声辐射不仅能改变细胞质膜的通透性,还能够提高脂质体介导的基因转染效率,增强基因介导的特异性和靶向性。     

柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及应用

为了建立柔嫩艾美耳球虫的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)培养体系,并应用于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞入侵活力检测,将CFDA-SE标记的子孢子接入DF-1细胞,利用流式细胞仪测定子孢子的细胞入侵活力。比较了37℃和41℃培养温度下,子孢子对DF-1、MDBK、Vero、BHK、MDCK五种细胞的入侵活力。优化了在子孢子入侵活力检测时,DF-1细胞最佳培养条件。结果表明,柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞中可发育为第一代裂殖子。在不同培养温度下,子孢子对DF-1细胞的入侵活力均高于其他细胞。优化后的DF-1细胞培养体系的培养程序为:用含100mL/L胎牛血清的DMEM稀释DF-1细胞,以每孔1×105个细胞铺被24孔板,37℃、50mL/L CO2培养24h后,用含50mL/L胎牛血清的DMEM换液后,每孔接入3×105个子孢子,41℃、50mL/L CO2培养8～12h,收集细胞进行检测。     

内毒素对仓鼠肾细胞抗氧化酶活性的影响及阳离子A对其的保护作用

将仓鼠肾细胞(BHK-21)随机分为3组:对照组(Ⅰ组)、内毒素组(Ⅱ组)、内毒素+阳离子A组(Ⅲ组),分别在第3、6、12、24小时收集细胞制备细胞匀浆,采用黄嘌呤氧化酶法检测总超氧化物歧化酶的活性;用比色法定量测定谷胱甘肽-S转移酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化氢酶、谷胱甘肽、总抗氧化能力活性;用考马斯亮蓝法测定细胞匀浆中的蛋白含量,探讨内毒素对体外培养仓鼠肾细胞的抗氧化酶活性的影响以及阳离子A对其的保护作用。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组各种抗氧化酶的活性显著降低(P<0.05);Ⅲ组与Ⅱ组相比,抗氧化酶活性显著增高(P<0.05)。证实内毒素能诱导体外培养的肾细胞的抗氧化酶活性降低,阳离子A能有效保护细胞内的抗氧化酶。     

绵羊胎盘滋养层细胞的体外培养与鉴定

为建立一种稳定、方便地获得较高纯度的绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法,为后续的细胞转染和RNA干扰试验提供细胞学基础,采用组织块法培养滋养层细胞,消化差速法纯化细胞,相差显微镜观察滋养层细胞的形态学特点,应用常规HE染色和免疫组织化学染色、透射电镜及PCR技术鉴定细胞来源。结果显示,倒置相差显微镜下,可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长。免疫组织化学染色显示,细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上,波形蛋白染色呈阴性;透射电镜可观察到滋养层细胞所特有的结构;台盼蓝排斥试验检测细胞活力,存活率超过95%,细胞活力良好。常规RT-PCR技术可扩增出滋养层细胞所分泌的特有的干扰素蛋白-1基因片段。证实该方法可以有效获得较高纯度的、具有生物学活性的绵羊绒毛膜滋养层细胞,为本实验室后续的体外研究提供试验基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。     

刚地弓形虫速殖子分离纯化方法的优化

为减少弓形虫假包囊和宿主细胞对试验的干扰,对弓形虫的速殖子进行了分离纯化。将弓形虫RH株虫体复苏后,接种于小鼠腹腔进行培养,72h后收集腹液,腹液经27G注射器针头抽吸后进行不同组合的非连续密度梯度(1.031×106 mg/L、1.056×106 mg/L、1.077×106 mg/L、1.123×106 mg/L Percoll)离心纯化。通过显微镜观察以及细胞计数等方法比较各组合的纯化效果。结果显示,经注射器针头帮助假包囊破裂后,使用非连续密度梯度离心,以密度为1.056×106 mg/L、1.077×106 mg/L Percoll不连续梯度3 000r/min离心30min,可以将速殖子和假包囊进行较高纯度的分离纯化。本研究为纯化高纯度的弓形虫速殖子提供了一种方法。     

鹅细小病毒VP3基因疫苗两种不同免疫方式对细胞免疫的影响

将构建的鹅细小病毒(GPV)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)转染鹅胚成纤维细胞(GEF),每隔12 h检测VP3蛋白的表达情况,同时以不同剂量分别通过基因枪轰击和肌肉注射免疫28日龄健康雏鹅,于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77和105 d采血,进行淋巴细胞增殖试验(MTT法)。结果,转染后第24 h即可在GEF中检测到GPV VP3蛋白,第60 h表达量达到高峰。试验组鹅外周血T淋巴细胞D490 nm值在免疫后第35 d达到最大。肌肉注射组和基因枪组免疫后第14~63 d、第7~63 d的D490 nm值分别与PBS对照组差异极显著;肌肉注射组及基因枪组免疫后第21~49 d的D490 nm值显著高于弱毒疫苗对照组;肌肉注射组及基因枪组免疫后第14~63 d的D490 nm值极显著高于空质粒对照组。表明,基因枪轰击和肌肉注射pcDNA-GPV-VP3均能诱导雏鹅产生良好的细胞免疫应答。     

新城疫病毒F48E9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。