PRRSV高致病性毒株和经典毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR鉴别方法的建立

根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法.用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性.应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、14、21 d分别采集全血,检测结果均为阳性.证实,本试验所建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株.     

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法.敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL.表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测.     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

美洲型与欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型经典毒株、高致病性变异毒株以及欧洲型毒株基因组的序列差异,设计2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株的多重荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.999以上;特异性强,只有PRRSV出现阳性反应,而与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性高,经典毒株、变异毒株、欧洲型毒株的检出下限分别为1.13、1.37、1.39copies/μL,均比普通RT-PCR敏感100倍;重复性好,组内及组间变异系数均小于1.5%。应用所建立的方法对采集的282份临床病料进行检测,结果 PRRSV阳性101份,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。结果表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可为PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。     

猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFRl和TNF-αSYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

分别针对猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1、TNF-α基因以及看家基因β-actin的序列设计了1对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测Fas、FasL、TNFR1、TNF-α及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法.该方法线性关系好(r2≥0.995),敏感性高,初始模板的检出下限除TNFR1为1×102 copies/μL外,其他均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%.应用所建立的方法对猪生殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中Fas、FasL、TNFRl和TNF-α mRNA的表达水平进行了检测.结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典毒株的序列差异,分别设计了1对特异性鉴别引物和1条TaqMan探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,建立的方法可鉴别诊断PRRSV变异株和经典毒株,具有较高的特异性;可以检测相当于1TCID50的病毒模板,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<10%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对13份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出11份阳性,高于常规RT-PCR方法。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法能检测高致病性PRRSV变异株,不仅特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于变异PRRSV的临床诊断和流行病学调查。     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSVORF7、PCV 2ORF1基因及PRVTK基因的核苷酸序列设计合成引物 ,建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV 2的RT PCR及PCR方法。应用该方法对 77份可疑病料进行了检测 ,以调查猪群中PCV 2与PRRSV和 (或 )PRV混合感染情况。结果表明 ,2 4份样品表现为PRRSV与PCV 2混合感染 ,占样品总数的 31.2 % ;17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染 ;9份样品表现为PCV 2与PRV混合感染 ,占 11.7% ;另外 ,还有一定比例的三重感染 ,共 8个样品 ,占 10 .4 %。结果显示 ,猪群中PRRSV、PRV与PCV 2的混合感染现象比较普遍     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒的变异分析

为了解河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR方法对2004～2007年采集的12个典型发病场的病料样本进行了PRRSV Nsp2和ORF5基因扩增、克隆和测序,利用DNAStar和DNAMAN软件对所测序列进行了分析.结果显示,扩增的ORF5基因氨基酸序列同源性为98.7%～100%,与美洲型和欧洲型PRRSV参考株的同源性分别为88.9%～100%和62.9%～63.5%;扩增的Nsp2基因氨基酸序列同源性为82.8%～100%,与参考毒株的同源性为76.5%～100%;从2006~2007年的样本中扩增的6个PRRSV Nsp2基因均在第481位和533~561位共缺失30个氨基酸;系统进化树分析表明,这6个样本株均属于美洲型,分属于2个基因亚群,其中HB0503株与BJ4、NJ1、HN1、LP1和VR-2332遗传关系较近,其他株与JXA1、SX和BJ株遗传关系较近.结果表明,危害河北省规模猪场的PRRSV已经发生了较大的变异,其中2004～2005年的样本株属低致病性PRRSV毒株,而2006～2007年的样本株属高致病性PRRSV毒株.     

截短的猪生殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达

根据GenBank上登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列,设计了1对引物用于扩增PRRSV M基因,经PCR、酶切及测序鉴定,成功构建了PRRSV M基因原核表达载体.重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting结果显示,出现一分子质量约为27.3ku的目的蛋白带,该表达蛋白可与PRRSV猪阳性血清发生特异性反应.表明,表达的蛋白具有良好的特异性.     

宁夏地区猪生殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及其变异分析

参考GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Jiangxi株和CH-la株的ORF5基因序列,设计并合成了1对引物,对宁夏回族自治区送检的18份PRRS阳性分离毒株进行RT-PCR扩增,获得约750 bp的DNA片段,将其分别克隆入pMD18-T栽体中,进行测序.应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332,BJ-4,RespPRRS MLV等毒株的ORF5序列进行比较,发现其核苷酸同源性为85.4%/～89.0%,与CH-la之间的核苷酸同源性为90.0%～98.2%,与欧洲代表株I,V的核苷酸同源性为55.9%～56.6%.基因系统进化树分析表明,发生于宁夏回族自治区的PRRSV属于美洲型,与CH-la遗传关系较近,归属同一基因亚型.     

四种猪呼吸道疾病综合征病原多重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)和猪肺炎支原体(M.hyo)的多重PCR方法,分别针对PRRSV的ORF1a基因、PCV2的ORF2基因、APP的OMLA基因和M.hyo的P46基因的保守区域设计4对特异性引物,优化反应体系及条件,建立了可同时扩增PRRSV(225bp)、PCV2(337bp)、APP(107bp)、M.hyo(176bp)相应基因的四重PCR方法。结果显示,该方法能单管同时特异地鉴别检测PRRSV、PCV2、APP、M.hyo 4种病原体,对猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌、猪呼吸道冠状病毒、猪流感病毒、猪细环病毒及猪细小病毒等无特异性扩增,说明该PCR具有良好的特异性;方法的灵敏度分别为195、272、241、321pg/μL。应用该方法对重庆市的61份样品进行检测,其中PRRSV、PCV2、APP、M.hyo的阳性率分别为22.9%(14/61)、18.0%(11/61)、8.2%(5/61)和18.0%(11/61)。该方法的建立为临床上4个病原的快速鉴别诊断提供了有力的技术手段。     

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒NASBA-ELISA

针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF1中编码Nsp2的基因序列设计引物,建立了核酸序列依赖性扩增(NASBA)方法,并结合微孔板中波相杂交和酶标显色反应检测NASBA扩增产物,建立了检测高致病性PRRSV的NASBA-ELISA.琼脂糖凝胶电泳显示,NASBA方法扩增出了特异性的目的条带.将NASBA产物RNA系列稀释后同时进行了ELISA和Northern杂交.结果显示,ELISA和Northern杂交最高可分别检测到1:50和1:30稀释的产物RNA.采用建立的NASBA-ELISA可检测到101.83 TCID50/mL的HuN4株PRRSV.该方法只对3株高致病性PRRSV的检测结果为阳性,对经典株PRRSV和其他猪源病毒的检测结果均为阴性.结果表明,NASBA-ELISA能够敏感并特异地检测高致病性PRRSV.     

猪脑心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

针对猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因序列设计并合成了l对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测EMCV核酸的SYBR Green I real-time PCR方法.检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.991;对初始模板的检出下限为1×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍;与其他猪源病毒,如口蹄疫病毒(FMDV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于3%.应用建立的方法检测了17份临床可疑病例的心、脑组织样本,结果1份为阳性.表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于EMCV的病原检测及定量分析.     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的PRRSV基因组序列,设计并合成了1对特异扩增ATCC VR-2332株的ORF6基因的引物.以ATCC VR-2332基因组为模板,通过RT-PCR扩增出586 bp的cDNA产物.将该cDNA片段经T-A连接插入pGEM-Teasy载体中,用重组质粒转化大肠埃希氏菌JM109,获得重组质粒转化菌.对重组质粒DNA进行PCR及酶切鉴定,证明插入的DNA片段与PCR扩增的DNA片段大小相符.对整个ORF6进行序列分析,将测序结果与已发表的ATCCVR-2332序列相比较,证实插入片段为PRRSV VR-2332的ORF6片段的cDNA.     

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝.分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性.表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测.     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的核衣壳蛋白基因 (N基因 ) ,并将其克隆到 pET 32a载体 ,构建了高效原核表达载体pETN。将 pETN重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌后 ,对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明 ,插入片段序列与PRRSV美洲型ATCCVR2 332株的ORF7核苷酸序列同源性达 99.9% ,与分离毒株的同源性达 99.0 %。