马疱疹病毒1型gD基因主要中和抗原区在大肠埃希氏菌中的表达

利用PCR技术扩增马疱疹病毒1型(EHV-1)gD基因主要中和抗原编码区,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pGEX-EHV-gD用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,重组gD蛋白以不溶性包涵体形式表达,与预期大小(43 ku)相符;Western-blotting分析表明,表达产物均能与抗EHV-1和EHV-4阳性血清发生反应。用重组蛋白免疫家兔获得的超免疫血清能中和EHV-1和EHV-4,且中和抗体效价较高,说明原核表达产物具有良好的免疫原性,可以用作ELISA包被抗原或重组基因疫苗。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法,以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因,克隆至pGEM-T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定,gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后,Western-blotting和ELISA分析结果表明,这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应,可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

小反刍兽疫病毒H糖蛋白基因原核表达载体的构建及表达

参照GenBank中小反刍兽疫病毒(PPRV)H抗原基因序列,人工合成了PPRV H基因,将其克隆至pUC18-T质粒中,转化E.coliJM109感受态细胞,构建并选择PPRV H基因克隆重组质粒,经核苷酸序列分析正确,将其克隆至pBAD/Thio-TOPO载体中,转化E.coliTOP10感受态细胞,核苷酸序列分析证实,成功构建了PPRV H基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导,可稳定、高效地表达PPRV H抗原。SDS-PAGE分析结果表明,用终浓度为0.2 g/L的L-阿拉伯糖诱导5 h的表达量最高,表达蛋白为分子质量约83 ku的融合蛋白;经薄层扫描分析,其表达产量约占菌体总蛋白的10%。Western-blotting检测表明,诱导的蛋白能与PPRV H蛋白单抗发生特异性反应,说明表达的融合蛋白中含有PPRV H糖蛋白抗原。     

山羊痘病毒糖蛋白基因ORF122的克隆及其原核表达

以山羊痘弱毒疫苗毒株AV41的细胞培养物中提取的总DNA为模板,通过PCR扩增获得山羊痘病毒(GTPV)ORF122基因片段。另设计1对引物,经PCR扩增获得缺失跨膜功能区的ORF122基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-32a中,构建了重组表达质粒pET-ORF122,将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导,成功表达出分子质量为32ku的融合蛋白。免疫印迹试验证实,表达的融合蛋白可以被GTPV阳性血清识别。经对该重组蛋白进行纯化,结果其纯度达到90%以上,产量达5.5mg/L。上述结果为GTPV重组诊断抗原的筛选和新型疫苗的研制奠定了基础。     

马链球菌兽疫亚种纤连蛋白结合蛋白的原核表达及其免疫原性的检测

根据已发表的纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FNZ)基因(fnz)序列,设计并合成1对引物,以马链球菌兽疫亚种(SEZ)ATCC35246菌株基因组DNA为模板,PCR扩增fnz基因,并定向将其克隆至表达载体pET-32a(+)中。重组质粒pET-32a(+)-fnz经酶切及测序鉴定后,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达,表达产物经Western-blot检测后进行纯化,得到了74ku的纯化蛋白。以纯化的FNZ与ISA206佐剂以1∶1的体积比混合后免疫ICR小鼠,每只小鼠背部皮下多点注射120μL(含蛋白22.5μg),14d后以同样方法进行加强免疫。间接ELISA检测结果表明,FNZ免疫组小鼠的血清FNZ抗体效价显著高于其他3个对照组。二免后第15天小鼠腹腔注射ATCC35246菌液5.0×105 CFU(10LD50),观察注射后10d内小鼠的临床表现及存活状况;结果显示,FNZ免疫组小鼠的存活率为62.5%,显著高于阴性对照组(0)和空白对照组(0),但低于SEZ灭活疫苗免疫组(87.5%)。结果表明,FNZ可使免疫小鼠对SEZ的感染产生一定的抵抗作用。     

马动脉炎病毒膜蛋白基因截短型的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

根据马动脉炎病毒膜蛋白(M)的核苷酸序列,设计合成了 1 对引物,从 pUC 18 M质粒中扩增出截短的膜蛋白M基因片段。对该片段及 pGEX 6P 1 载体双酶切并连接,成功构建了原核表达载体pGEX 6P Mt。将此重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,对培养条件及诱导表达条件等影响表达的因素进行了优化;诱导后菌体裂解物经 SDS PAGE分析发现,在约 34 ku处出现了 1条特异性的蛋白条带,其分子质量与预期的M截短蛋白的分子质量相符,并随着诱导时间的延长而变化,在诱导后4 h达到高峰。结果表明,膜蛋白 M基因截短型在大肠埃希氏菌中得到了高效表达。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPc)基因。测序分析表明,所克隆的羊PrPc基因片段大小为771 bp,包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列,其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21(DE3),挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达,收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明,PrP基因在大肠杆菌中成功表达,并能被抗牛PrPc单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%~45%,目的蛋白以包涵体的形式存在,包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

尼帕病毒截短G蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以截短的尼帕病毒（NiV）G基因原核表达产物为抗原建立检测尼帕病毒抗体的间接ELISA检测方法。对编码尼帕病毒G蛋白基因的部分序列进行扩增,将扩增获得的目的片段克隆至原核表达载体pET-30a（+）,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。菌落PCR鉴定后,在最佳诱导条件下表达目的蛋白。用Ni-NTA柱纯化截短的G蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。以纯化的蛋白为抗原建立尼帕病毒抗体间接ELISA检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性进行验证。结果显示：成功构建重组质粒pET-30a(+)-NiV-G;表达的尼帕病毒截短G蛋白分子质量为50 ku,与预期值相符;截短的G蛋白能被His-tag抗体、抗尼帕病毒G蛋白粗提IgG识别。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法检测已知阳性血清尼帕病毒抗体效价为1︰20 480,裂谷热病毒、西尼罗病毒及克里米亚-刚果出血热病毒阳性马血清的检测结果均为阴性,且该方法批内、批间试验变异系数均小于10%。结果表明,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-NiV-G,并诱导表达尼帕病毒截短G蛋白。以该蛋白建立的尼帕病毒抗体...     

旋毛虫TsP53抗原基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法从旋毛虫肌幼虫总RNA中获得TsP53基因片段,限制性酶切后连接到表达质粒pET30a中,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR分析及测序鉴定后,将重组表达质粒pET30a-TsP53转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达产物,对表达产物纯化后通过间接ELISA鉴定重组蛋白的抗原性。结果显示,成功构建了重组表达质粒pET30a-TsP53,测序结果表明插入片段为1 176 bp,编码391个氨基酸残基,与旋毛虫P53抗原基因序列(U25127)有99%的同源性,开放阅读框正确。含有pET30a-TsP53重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子质量约为50 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA结果表明,重组抗原可以被旋毛虫感染不同时期的猪血清特异性识别,有望用于旋毛虫病的免疫诊断。     

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。     

鸭瘟病毒gD基因胞外区的原核表达及ELISA检测方法的建立与应用

为研究分离鉴定的鸭瘟病毒gD基因(GenBank登录号:EU195085)及其编码蛋白的应用,采用PCR方法从鸭瘟病毒CHv毒株DNA中获取编码gD胞外区基因729bp片段,构建重组表达载体pET32a-gD,转化受体菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达重组gD蛋白。结果显示,该重组蛋白分子质量约为31ku,为gD胞外区与载体6个组氨酸的融合表达产物,与gD胞外区预期大小一致(27.5ku);经离心收集菌体,超声裂解后,SDS-PAGE分析结果显示,gD蛋白主要以包涵体形式表达;将包涵体溶解后进行Ni-NTA亲和层析可较好地纯化重组蛋白。Western-blot检测显示,gD蛋白能与兔抗鸭瘟病毒血清特异结合,具有较好的免疫反应性。利用该蛋白建立了ELISA检测方法,优化了该方法的各个反应条件,并进行了初步应用,为该方法的临床应用奠定了基础。     

土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白基因的原核表达

将pGEM-TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白(TM)基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+),重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中经1 mmol/L IPTG诱导表达出一37.5 ku的融合蛋白。该蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测,出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明,纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别,这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。     

鸡CTLA-4胞外区的原核表达与免疫佐剂作用

为了探索鸡细胞毒性T细胞相关抗原-4(CTLA-4)胞外区(ChIgV)作为免疫佐剂的可行性,采用RT-PCR从鸡外周血淋巴细胞扩增ChIgV编码序列;测序结果显示,其核苷酸序列与已发表序列的同源性为100%。将猪CD151基因片段克隆入原核表达载体pET-30a和ChIgV融合表达载体pET-ChIgV,获得重组表达载体pET-CD151和pET-ChIgV-CD151。分别将pET-CD151和pET-ChIgV-CD151转化BL21(DE3)大肠杆菌,用IPTG诱导重组菌表达,SDS-PAGE结果显示,能表达预期的18ku和28ku重组蛋白,表达产物均为不溶性包涵体。采用包涵体纯化法和尿素变性/复性法获得了纯化的可溶性重组蛋白。以每只500μg剂量2次免疫SPF鸡,用间接ELISA测定血清抗体效价,结果显示,CD151免疫组在初免后第3周特异抗体检测为阳性,第5周抗体效价达到1∶13 000;ChIgV-CD151免疫组在初免后第2周特异抗体检测为阳性,第4周抗体效价达1∶53 000。分别用CD151和ChIgV-CD151免疫血清进行Western-blot检测,结果显示,均能在CD151阳性猪肺巨噬细胞膜蛋白中检测到预期的29ku蛋白条带,而在CD151阴性PK-15细胞膜蛋白中不能检测到相应的蛋白条带。表明,ChIgV可作为鸡抗原提呈细胞的靶向导入分子和新型免疫佐剂。     

抗菌肽Dermadistinctin-K的原核表达及生物活性鉴定

为了获得抗菌肽Dermadistinctin-K并鉴定其生物活性,依据GenBank中的氨基酸序列,使用化学合成和PCR相结合的方法获得了完整的Dermadistinctin-K基因序列;使用表达载体pET-32a(+)构建工程菌;用IPTG诱导融合蛋白表达并优化其表达条件,在IPTG终浓度0.1mmol/L下诱导5h表达量最大;最后用His-tag protein Purification kit纯化了融合蛋白,使用肠激酶酶切获得目的蛋白,并进行生物活性鉴定。分析结果表明,抗菌肽Dermadistinctin-K具有抗菌活性和一定的耐热性,其生物活性与pH值密切相关。     

环形泰勒虫SPAG蛋白的原核表达及反应原性分析

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中进行表达,并对SPAG重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,获得的SPAG基因片段长度为882 bp,重组蛋白分子质量约为42 ku。反应原性分析显示,该重组蛋白可与环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,与中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应。本研究结果表明,SPAG蛋白有较好的反应原性和种特异性,可作为检测环形泰勒虫的候选抗原建立相应血清学诊断方法。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒(AIV)A/Goose/HLJ/p46/2003(H5N1)的NS1基因,将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析,表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示,重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后,经0.3mmol/L的IPTG诱导,融合蛋白MBP-NS1得到大量表达,融合蛋白以可溶形式存在,分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明,融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应,而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法,为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。     

鹅细小病毒vp1基因的原核表达及抗原性分析

将鹅细小病毒(GPV)H1株vp1基因从pMD18T-vp1亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点,构建了原核表达载体pGEX-6P-vp1,将其转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了108ku的融合蛋白,该融合蛋白经亲和层析纯化并经Western-blot检测。结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。