运用二代测序技术拆分混合STR分型

目的探讨二代测序技术在混合STR分型拆分中的应用。方法对一例强制猥亵妇女案中受害人颈部的拭子和血样作DNA提取,以Precision ID GlobalFiler^TM NGS STR Panel v2试剂盒制备文库,经Ion S5测序仪测序,运用Torrent_Suite_v5.2.1软件进行数据分析后,将检测基因座的序列多态STR分型与长度多态STR分型进行比较。结果在D8S1179、D21S11、D2S441、D2S1338、D10S1248五个基因座发现存在序列特异的等位基因亚型,利用这些亚型对混合STR分型进行了成功拆分。结论二代测序技术提供的等位基因序列信息可对混合STR分型的拆分起到帮助作用。     

基于二代测序的24个STR基因座序列多态性

目的对95名中国汉族无关个体的24个STR基因座序列多态性进行调查。方法采用Thermo Fisher公司25重早期测试试剂盒进行STR基因座复合扩增,应用HID-Ion AmpliSeq~(TM)文库试剂盒进行文库构建,使用Ion PGM~(TM)基因测序仪进行测序反应,对Ion Torrent Suite~(TM) v4.6软件显示的STR基因分型结果分析评估,使用PowerStats分析软件计算法庭科学参数,并与STR长度多态性的参数进行比较。结果 24个STR基因座共观察到252个不同重复序列的等位基因。其中,12个STR基因座具有相同长度的不同等位基因核心序列,其累计随机匹配概率为3.5×10~(-15),其累计非父排除率达0.999 998 2。序列多态与长度多态STR的累计随机匹配概率相差两个数量级。结论针对调查的中国汉族人群,本文24个序列多态STR基因座具有较好的个体识别能力,该数据为法医STR基因座序列多态性研究提供很好的参考。     

基于二代测序的混合检材精细化分型研究

目的基于二代测序平台进行混合检材精细化STR分型,并评估其法医学应用价值。方法收集性侵案件中3例混合检材及其比对样本,采用M48磁珠提取纯化试剂盒提取样本DNA,使用Foren SeqTM DNA Signature Prep试剂盒制备文库,Mi Seq FGx平台进行测序,Foren SeqTM Universal Analysis v1.2.1软件进行数据分析,将STR序列多态分型与长度多态分型进行比较。结果对3例混合检材STR分型进行拆分,在D3S1358、D13S317与D9S1122基因座发现存在同一长度多态等位基因包含两个个体的序列多态等位基因的情况。结论二代测序技术可对混合检材进行精细鉴别,为混合分型数据拆分提供更多线索和依据。     

基于高通量测序进行无创产前亲子鉴定的可行性

目的初步探讨基于高通量测序进行STR分型的技术方法应用于无创产前亲子鉴定的可行性。方法选择13个STR基因座(6个常染色体STR基因座,6个Y染色体STR基因座,1个性别判定基因座),进行复合PCR扩增和高通量测序文库构建后,采用Ion PGM400高通量测序平台进行测序,并采用自主研发软件NGS-STR genotyper(perl脚本)进行STR分型,本文简称上述过程为NGS-STR分型。对13个母子配对混合样本(母亲:儿子=2%~50%)、1组家系样本进行了上述NGS-STR分型,旨在(1)了解其在混合样本中的灵敏度及分型情况;(2)了解其在无创产前亲子鉴定中的应用可能性。结果 (1)当混合样本中低组分(儿子)的比例超过8%,所有基因座均可检出低组分的STR信息;(2)对1例血浆样本进行NGS-STR分型,共计69.2%的基因座可检出胎儿的STR基因型信息,且所有检出基因座均符合孟德尔遗传规律。结论初步证明了NGS-STR分型技术具有进行无创产前亲子鉴定的可行性。     

基于下一代测序的全解析度STR分型研究进展与展望

下一代测序技术具有高通量、高速度、集成化、低成本等显著优势,近年来已在科研和临床诊断领域得到广泛应用,在法医遗传学领域亦具有重要应用前景。当前主流的STR分型方法仅关注序列的长度多态性,然而由于核心重复结构存在差异或扩增区段内存在SNP,序列长度相等的等位基因可能是具有遗传稳定性的完全不同的等位基因,此类STR序列多态性是个体识别或亲缘关系分析的宝贵资源。基于下一代测序的STR分型在现有数据输出方式基础上,允许进一步关注STR的序列多态性,对STR基因座进行全解析度分型,显著提升STR基因座的个体识别能力。本文以法医STR遗传标记和下一代测序技术为关注焦点,系统综述基于下一代测序的全解析度STR分型领域国际最新研究进展,深入探讨该技术在法医DNA实验室的实际应用潜力和可能面临的挑战,希冀对相关研究和实践提供参考。     

运用法医学二代测序技术侦破19年久冷案

基于Y染色体STR(Y-STR)多态性的男性家系排查技术帮助全国各地破获了诸多冷案积案。然而对于出现明显降解的生物检材,或因检出Y-STR基因座数量过少而无法开展有效排查。STRSeqTyperY68男性家系精细化排查试剂盒,定位于二代测序技术,利用Mi Seq FGx二代测序平台可单管实现52个单拷贝Y-STR基因座、6个二拷贝Y-STR基因座、1个三拷贝Y-STR基因座和1个性别判定基因座的分型检测,并能同时支持STR长度和/或序列多态分型,全部基因座扩增子长度在350bp以下,且其中62个不大于300bp,适用于降解检材的检测。本文报道一起长达19年未破的强奸杀人案,用传统STR检测方法仅得到24个Y-STR基因座分型,部分300bp以上的Y-STR片段未检出,但通过二代测序方法使用STRSeqTyperY68试剂盒完整得到了67个Y-STR和1个性别基因座分型,从而帮助办案单位锁定了嫌疑人所在的男性家系,为案件侦破提供了关键技术支撑。     

大规模汉族个体15个STR基因座遗传多态性调查

本文利用苏州市公安系统DNA数据库资源,进行大规模汉族人群的15个基因座的遗传多态性分析。采用Amp FISTR Identifiler试剂盒、Amp FISTR Identifiler Plus试剂盒、AGCU 17+1试剂盒进行扩增,经测序后获得510 000名汉族个体15个STR基因座的DNA分型,应用Excel软件计算等位基因的分布频率等群体遗传学数据。在15个STR基因座共检出等位基因344个、基因型1890个。所调查的汉族人群15个基因座具有较好的识别力。     

D1S549基因座分型标准物的克隆制备方法及其群体遗传学研究

目的 采用分子克隆技术建立制备大量优质标准 STR基因座等位基因分型标准物的方法,解决长期困扰 STR分型上存在的准确性和标准化问题。方法 先用 PCR扩增出 D1S549基因座的 8个等位基因片段,将其插入 pUC重组质粒中,经 DNA测序分析证实插入片段的结构及大小,用国际标准将插入的等位基因片段进行命名,最后经转染、扩大培养,扩增及再鉴定后制备出标准的 D1S549等位基因分型标准物。结果应用此分型标准物,调查了成都地区汉族 ,甘肃回族及新疆维族群体 D1S549基因座的基因型分布频率。结论 表明该法制备的 STR基因座等位基因分型标准物适用于法医学鉴定实践, D1S549基因座是一个适合我国群体分析和法医学遗传分析的遗传标记。     

微量DNA的短串联重复序列分型可行性

目的了解微量DNA分型的法医学应用的可行性。方法一系列浓度的DNA模板用PowerPlexTM16System试剂盒扩增,并用ABI377DNA测序仪进行短串联重复序列(STR)的分型。结果当模板量小于250pg时,部分位点发生了等位基因漏扩,并出现非特异带、杂合子扩增不平衡等干扰分型的杂峰。结论上述这些不正常的现象可能会导致分型错误。在对微量检材的DNA检验结果进行判型时一定要小心谨慎,全面考虑。     

基于Ion Torrent PGM~(TM)测序系统的人mtDNA全测序分析

目的应用Ion Torrent PGM~(TM)测序系统对人线粒体DNA(mitochondria DNA,mtDNA)全序列进行分析检测,研究不同组织间mt DNA序列差异情况。方法通过法医尸体检验采集6名无关个体的组织样本,包括胸腔血液、头发、肋软骨、指甲、骨骼肌和口腔上皮。使用4对引物对线粒体全序列进行扩增,应用Ion Shear~(TM)Plus Reagents试剂盒和Ion Plus Fragment Library试剂盒等构建文库,并在Ion Torrent PGM~(TM)测序系统上进行线粒体基因组全序列测序,并针对异质性位点和在HVⅠ区域突变位点,进行Sanger测序验证。结果所有样本的全基因组mtDNA都扩增成功,6名无关个体分属于6种不同的单倍型,同一个体不同组织之间mtDNA存在异质性差异。异质性位点和HVⅠ区域突变位点采用Sanger测序结果均得到验证。通过Kappa统计方法进行一致性检验后发现,相同个体不同组织的mtDNA序列检验结果仍具有较好的一致性。结论本研究所采用的人线粒体基因组全序列的测序检验方法,可以检测出同一个体不同组织间mtDNA的异质性差异,该差异具有较高的一致性,该结果对mtDNA在法庭科学中的应用具有指导作用。     

二代测序技术在法医学中的应用

随着二代测序技术的快速发展,其高通量和低成本在生命科学领域应用广泛,测序的通量更高,测序时间和成本不断下降,使得其被广泛应用于微生物研究、古DNA研究、临床诊断、法医学研究等。本文阐述了二代测序技术平台及其遗传标记在法医学中的应用,包括STR分型、SNP分型、HLA基因型预测以及在降解检材中的应用等。     

二代测序技术在Y染色体遗传标记分型中的法医学应用

法医遗传学领域常利用Y染色体的父系遗传特点,对非重组区遗传标记进行检测并用于亲缘关系鉴定、混合斑检测、家系排查以及种族推断等研究.目前毛细管电泳仍是应用最为广泛的检测技术,基于该技术的商业化检测试剂盒及数据分析处理系统十分成熟.随着生物信息量的增长,传统检测技术通量低的弊端逐渐显现,推动了法医DNA分型技术的革新.近年...     

国产Goldeneye~(TM) 20A试剂盒性能指标验证

目的测试国产GoldeneyeTM20A试剂盒技术性能指标,评估其法医学应用能力。方法从方法学验证、准确性、峰值均衡性、灵敏度、批次间试剂及稳定性测试、耐受性、不同检材的适应性与一致性、种属特异性、混合样本等9个方面对GoldeneyeTM20A试剂盒进行测试。结果阳性DNA样本分型正确,内标和等位基因分型标准物符合要求;等位基因间的均衡性≥83%,同一荧光标记基因座间的均衡性≥55%,不同标记物间的均衡性≥52%;0.125ng DNA阳性样本可检出全部STR基因座分型,不同批次间和反复冻融后试剂盒测试可以获得正确分型,对降解检材和混有抑制剂的样本等具有一定的耐受性,能对案件中多种检材进行分型且分型结果一致,具有一定的种属特异性和混合DNA样本检测能力。结论国产GoldeneyeTM 20A试剂盒可用于法庭科学实际检案与建库。     

The effectiveness of various strategies to improve DNA analysis of formaldehyde-damaged tissues from embalmed cadavers for human identification purposes

Formalin-fixed tissues provide the medical and forensic communities with alternative and often last resort sources of DNA for identification or diagnostic purposes. The DNA in these samples can be highly degraded and chemically damaged, making downstream genotyping using short tandem repeats (STRs) challenging. Therefore, the use of alternative genetic markers, methods that pre-amplify the low amount of good quality DNA present, or methods that repair the damaged DNA template may provide more probative genetic information. This study investigated whether whole genome amplification (WGA) and DNA repair could improve STR typing of formaldehyde-damaged (FD) tissues from embalmed cadavers. Additionally, comparative genotyping success using bi-allelic markers, including INDELs and SNPs, was explored. Calculated random match probabilities (RMPs) using traditional STRs, INDEL markers, and two next generation sequencing (NGS) panels were compared across all samples. Overall, results showed that neither WGA nor DNA repair substantially improved STR success rates from formalin-fixed tissue samples. However, when DNA from FD samples was genotyped using INDEL and SNP-based panels, the RMP of each sample was markedly lower than the RMPs calculated from partial STR profiles. Therefore, the results of this study suggest that rather than attempting to improve the quantity and quality of severely damaged and degraded DNA prior to STR typing, a more productive approach may be to target smaller amplicons to provide more discriminatory DNA identifications. Furthermore, an NGS panel with less loci may yield better results when examining FD samples, due to more optimized chemistries that result in greater allelic balance and amplicon coverage.     

Make it "SNPPY" - Updates to SRM 2391d: PCR-Based DNA Profiling Standard

Standard Reference Material (SRM) 2391d: PCR-Based DNA Profiling Standard was released to the forensic community in 2019. Next Generation Sequencing (NGS) was used as the primary method of certification, where certified values were assigned when a high coverage sequence string was available for a marker. Using NGS to assign values has allowed for additional marker sets beyond short tandem repeat (STR) loci, including single nucleotide polymorphisms (SNPs) and mitochondrial DNA (mtDNA) whole genome sequences, to be included in the Certificate of Analysis (COA). Since the 2019 release, several commercial NGS panels have become available including the Verogen ForenSeq mtDNA Control Region, mtDNA Whole Genome, MainstAY, and Kintelligence Kits. In addition, three community Ion AmpliSeq panels from Thermo Fisher (MH-74 Plex, VISAGE, and Y-SNP) are now available. While the mtDNA whole genome sequence for the components are already included and no new STR markers are introduced by MainstAY, the other recently released panels allow for the inclusion of > 11,000 additional SNPs (e.g., identity, ancestry, phenotype, kinship, and X- and Y-SNPs) and 74 microhaplotypes to the COA for SRM 2391d in an update completed by fall of 2022.