脑心肌炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测脑心肌炎病毒(EMCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),参照GenBank中EMCV基因组序列(X74312.1),针对EMCV的3D基因保守区域设计并合成了4条引物,对建立的反应体系进行条件优化,并进行特异性、敏感性试验及临床样本的检测。结果显示,成功建立了EMCV LAMP检测方法,且当内、外引物浓度比例为5∶1(即内、外引物浓度分别为50μmol/L、10μmol/L),反应温度为64℃,反应时间为60min时反应体系可达最佳。特异性和敏感性试验表明,该方法能够特异性地检测EMCV,且敏感性比常规RT-PCR法高10倍。分别用建立的LAMP法与ELISA法对临床样本进行检测,结果二者的符合率为97%。表明建立的LAMP方法特异性强、敏感性高,可适用于EMCV临床样本的快速检测。     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

施马伦贝格病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据GenBank中施马伦贝格病毒S基因的保守区序列,设计1组对应目的片段6个区域的4条特异性引物(包括1对内引物和1对外引物)进行核酸扩增,建立RT-LAMP反应体系并进行反应条件优化,确定最佳内外引物浓度分别为1.2、0.15μmol/L,最佳反应条件为61℃保温60min。特异性和敏感性试验结果表明,本研究建立的施马伦贝格病毒RT-LAMP能检测到133 copies/μL的施马伦贝格病毒克隆质粒。结果表明,该RT-LAMP具有特异性强、灵敏度高和快速简便等优点,是在进出境口岸、养殖场或基层实验室等场所开展快速检测的良好方法。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增诊断方法的建立

通过对GenBank中登录的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白基因序列进行分析,根据p72保守区序列设计合成了内(FIP,BIP)、外(F3,B3)2对引物,其中外引物扩增片段的大小为184bp。通过对反应条件进行优化,建立了非洲猪瘟LAMP检测方法。结果显示,该方法在62℃保温60min即可完成,最低可检测到1×101 copies/μL的病毒DNA,与常规PCR方法相比灵敏度高100倍。对ASFV、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒基因组DNA同时检测,结果仅有ASFV出现条带,而其他均未出现目的条带。表明,建立的ASFV-LAMP诊断方法具有较好的特异性和敏感性。     

犬细小病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

参照GenBank中犬细小病毒(CPV)VP2基因保守区域序列设计合成特殊的内、外引物,在扩增反应体系中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,通过恒温荧光检测仪Deaou-308C扩增检测,建立了一种快速检测CPV的实时荧光环介导等温扩增(LAMP)方法。结果显示,这种方法对CPV具有特异性的扩增反应,对照病毒核酸的扩增结果均为阴性。灵敏度试验最低可检出3.72 copies/μL的病毒核酸。重复性试验结果表明,其检测重复性良好。对30份临床宠物犬的粪便样品进行检测,与免疫胶体金检测试纸方法进行比较,符合率为90%。将本方法初步应用于大熊猫粪便中犬细小病毒的检测,结果表明,从大熊猫基地采集的84份粪便样品中有16份为细小病毒阳性,阳性率为19.0%。本方法在63℃下恒温45 min可以完成检测,操作简单、灵敏度高、特异性强,通过恒温实时荧光检测仪可实时检测及自动判读检测结果,对大熊猫的早期诊断非常重要。     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

犬瘟热病毒SD(14)7株对比格犬的致病性研究

对3~4月龄比格犬经肌肉注射方式接种犬瘟热病毒(CDV)SD(14)7株1 mL(病毒含量为106.0 TCID50/mL),并进行体温、淋巴细胞数、眼鼻直肠排毒和组织病毒含量及分布等指标检测,评价变异株SD(14)7对比格犬的致病水平。结果显示,CDV感染后第2天比格犬出现CDV感染的典型特征,如眼和鼻分泌物增多,淋巴细胞明显减少,然而动物的体温变化无明显的“双相热”特征。CDV定量检测结果显示,比格犬攻毒后第10天开始通过眼鼻和直肠向外界排毒,CDV在脾中含量最高。病理剖检可见脾有坏死、肺炎症出血等,病理组织HE和免疫组织化学检测发现脾有严重的充血,淋巴细胞中有CDV抗原,证实该毒株主要感染淋巴组织和器官。此外,比格犬大脑部分神经细胞严重肿胀,在脑中可检测到CDV,表明SD(14)7株具有一定的神经嗜性。本试验结果为进一步鉴定犬瘟热病毒感染比格犬的毒力因子和免疫原性以及疫苗免疫效果的评价奠定了基础。     

快速检测犬瘟热病毒的实时荧光RPA方法的建立

针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,并进行了敏感性和特异性试验,建立了CDV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测方法。结果表明,该实时荧光RPA方法在39℃恒温反应25 min能特异性扩增目的基因,与其他犬病毒以及CDV同属的麻疹病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一致的敏感性;通过对CDV阳性犬的组织样品、体表样品和不同时期分离鉴定的临床样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样25 min内即可判读结果,可满足CDV快速检疫的需要。     

小反刍兽疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据PPRV基质蛋白(M)基因保守序列设计2对种特异性引物,通过反应条件优化和特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了PPRV可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,该方法最佳反应条件为62℃1 h,与口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、狂犬病病毒和犬瘟热病毒这5种羊常见病毒无交叉反应,最低可检测到2.4×10~(-9)ng/L的RNA,敏感性是普通RT-PCR检测方法的1 000倍。该方法与普通RT-PCR的总符合率为95.23%。结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、操作简便、快速和可视化的优点,可用于羊PPRV感染的现场可视化快速诊断检测。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

六部门动态优化模型在吉林老工业基地产业结构优化升级中的运用

产业结构问题是我国当前亟须解决的重大问题,产业结构的优化升级是经济均衡增长的关键。在相关理论方法还不够完善的背景下,构建适合国情的产业结构动态优化的理论与方法,为我国的结构调整提供有价值的参考,将具有深远的理论与实践意义。产业结构动态优化模型体系与吉林省的实证研究相结合,可以发挥区域优势,以科技进步促进产业的结构升级,解决供需结构失衡的深层矛盾。     

东北地区资源利用效率及对策研究

我国"十一五"规划明确指出,"十一五"期间我国要把节约资源作为基本国策,加快建设资源节约型社会。东北地区由于长期以资源开发和产品初加工产业为龙头的粗放型的经济增长方式,使其自然资源的优势逐渐丧失。经济增长方式转变的根本点在于提高资源利用效率,用较少的资源消耗获得较高的经济产出。以能源为例,对东北地区资源利用效率进行分析,历年的计算结果显示:东北地区能源消费总量增长减缓,能源消费结构逐步得到优化,能源利用效率逐年提高,但从绝对值看,仍低于全国平均水平。为构建资源节约型社会,可以通过优化能源消费结构、提高能源利用效率、优化产业布局等,促进东北地区经济发展与人口、资源与环境的全面协调。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL18克隆质粒扩增获得了ChIL18全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序,鸡IL18全基因被正确重组到pcDNA3.1( )真核表达质粒上;将重组真核表达质粒pcDNA3.1( )ChIL18转染COS7细胞,转染细胞中含ChIL18基因的mRNA。SDSPAGE分析表明,表达产物是与ChIL18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。     

雏鸭胸腺生长指标的动态观测及组织学观察

通过对1～49日龄雏鸭胸腺发育的组织学观察及胸腺重量、胸腺指数和外周血T淋巴细胞α-醋酸萘酯酶阳性率(ANAE )的测定,研究了雏鸭胸腺的生长及组织发育规律。结果显示, 胸腺重量随日龄增长逐渐增加;胸腺指数在28日龄时达最高;1～28日龄时外周血T淋巴细胞 ANAE 上升幅度较大;21～28日龄时胸腺小叶数量增多,并显著增大;28日龄时皮质部主要为小淋巴细胞;胸腺小体有3种形态。表明,雏鸭在1～14日龄时胸腺生长较缓慢,21～28日龄时生长十分迅速,28日龄时胸腺中大部分T淋巴细胞已发育成熟,35～49日龄时胸腺发育已趋于稳定; 胸腺小体是具有高度活性的结构,与清除退变上皮有关。