牛疱疹病毒1型洛精株gD基因的分子克隆及序列分析

根据已发表的牛疱疹病毒1型(BHV-1) P8-2株gD基因的核苷酸序列设计了1对特异性引物,对我国BHV-1洛精株gD基因进行PCR扩增,并对其克隆、测序和分析.结果表明,gD基因的核苷酸长度为1 251 bp,其编码417个氨基酸;BHV-1洛精株gD与国外报道的P8-2株的gD基因的核苷酸的同源性高达99.92%,氨基酸的同源性高达100%.这说明BHV-1的gD糖蛋白高度保守.     

鸭Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列测定

从植物血凝素 (PHA)刺激的鸭外周血单核细胞提取总RNA ,采用RT PCR扩增鸭Ⅰ型干扰素 (DuIFN Ⅰ)基因 ,将其克隆到pMD 1 8T载体中 ,进行序列测定。克隆到的鸭Ⅰ型干扰素基因与已公布的DuIFN α核苷酸序列同源性为 99.65 % ,氨基酸序列同源性为 98.95 %。同时表明 ,鸭外周血单核细胞在PHA刺激下能够表达Ⅰ型干扰素mRNA。     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段,并将其克隆至pGEM T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明,6个NDV分离株 HN基因片段长度均为1 704 bp,编码568个氨基酸;彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为 96.0%~99.8%和98.6%~100%,与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为 96.8%~98.4%;但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低,为88.2%~91.0%。     

鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析

用干扰素诱导剂poly(I)/(C)诱导鸡胚成纤维细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列.序列分析表明该基因编码区长2118 bp,编码705个氨基酸残基,其第631位为天冬酰胺,理论上推测具有抗病毒活性.通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示,北京白鸡Mx基因与WL-N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近.北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为49.5%～76.8%,氨基酸同源性为44.1%～61.6%.据此可以推断克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构,不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关.     

4株猪瘟流行野毒株病毒结构蛋白E2基因的核苷酸序列分析

应用RT-PCR和nPCR扩增由4株甘肃省近期(1997-1998)猪瘟流行野毒株的E2基因,将其克隆到pGEMTEasy载体上,经转化、筛选、鉴定后,测出核苷核序列.4株流行毒株的E2基因核苷酸序列同源性为89.2%-99.7%,相应的氨基酸序列同源性为93.8%-99.0%.这4株流行毒株;与C-株(疫苗种毒)E2基因的核苷酸序列同源性为82.2%-84.3%,相应的氨基酸序列同源性为87.9%-90.2%,表明近期猪瘟流行毒株与C-株的gp55蛋白之间存在一定的差异.     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒 (IBDV )YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析 ,并和相关毒株进行了比较。结果表明 ,YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有 92 .5 %和 91.8% ,与超强毒株UK6 6 1的核苷酸和氨基酸同源性均为97.6 % ,而与当地鸡群中分离的超强毒株HN94 2的核苷酸和氨基酸同源性则高达 98.1%和98.4 % ,该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的 2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测 2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门 (Shimen)株进行了比较分析。结果显示 ,GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为 82 .1%和 82 .6 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 87.9%和 88.7% ;GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为 83.6 %和 84 .0 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 89.3%和 90 .1%。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA ,根据已报道的猪瘟病毒基因组序列 ,设计合成了 2对引物 ,以总RNA为模板 ,利用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、套组聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术 ,对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的 5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定 ,用DNAstar软件比较分析了 5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株 (C ST株 )E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现 ,5株野毒与C ST株核苷酸序列的同源性为 81.7%～ 83.1% ,氨基酸同源性为 87.3%～ 88.6 % ,表明它们之间存在较大的差异 ;但 5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达 98.8%～ 99.3% ,氨基酸同源性为96 .6 %～ 99.2 % ,表明它们之间的差异较小     

鸭白细胞介素-2基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中登录的鸭IL-2基因序列设计并合成了1对特异性引物,以经ConA诱导的广州鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度为360 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切鉴定、PCR鉴定及序列测定结果表明,获得了鸭IL-2成熟蛋白基因的完整克隆.测序结果表明,该成熟蛋白基因由360个核苷酸组成,共编码119个氨基酸.克隆的鸭IL-2基因与GenBank上序列号为AYl73028及AF294322的鸭IL-2基因的同源性高达99.4%.将目的基因克隆至真核表达载体pPICZáC上,构建了重组质粒pPICZáC-DuIL-2.酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了鸭IL-2基因.SDs-PAGE分析证实,鸭IL-2基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达成功,表达的重组蛋白的分子质量约为14.3 ku.     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒(AIV)分离株血凝素(HA)基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析。结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸。2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79(H7N1)的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94(H7N2)株同源性很低(仅65.0%),而与以色列、意大利H7N2AIV的同源性较高(为96%~97%);2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内。推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸(R-)残基,符合低致病力AIV的基因特征。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

云南省猪圆环病毒的分子流行病学调查及其2型cap基因遗传多样性分析

采用猪圆环病毒(PCV)通用PCR技术和PCV-2特异性PCR技术检测云南省2007～2008年采集的120份病猪组织样品,结果获得PCV-2阳性样品21份.选取12份有代表性的阳性样品进行cap基因的扩增、纯化,将产物克隆至pMD18-T载体测序,并与已知参考毒株进行比对及系统发育分析.结果显示,云南省12份阳性样品cap基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为92.4%～99.7%和94.4%～99.6%;与国内PCV-2毒株cap基因的核苷酸和氨基酸序列同源性为89.3%～92.9%、88.4%～94.0%;与国外毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性为90.0%～99.4%、93.6%～99.6%.有25个氨基酸位点存在变异,其中14个位点位于抗原表位区;12份阳性样品可划分为3个进化分枝(1.1.1.1、1.1.2、1.2),其中1.1.2、1.2可能是新出现的分枝.     

鸭疫里氏杆菌地区流行株的分离与外膜蛋白A的变异性分析

2010年从安徽省和江苏省境内发病鸭的病理组织中分离到8株鸭疫里氏杆菌(RA),分别被命名为AH1、AH2、AH3、AH4、JS1、JS2、JS3、JS4,其中AH1、JS4为血清1型,AH2、AH3、AH4、JS1、JS2、JS3为血清2型。8株RA的菌体形态、生化特性、PCR鉴定结果相同,但致病力不同,AH1毒力最弱,对鸭的发病致死率仅为16.7%。序列分析结果显示,8株分离菌的外膜蛋白A(OmpA)基因的核苷酸序列同源性为96.9%～100%,氨基酸序列同源性为98.2%～100%。将8株RA与GenBank中登录的其他55株RA的OmpA进行变异性分析,结果其核苷酸序列同源性为89.6%～100%,氨基酸序列同源性为90.2%～100%。从系统发育进化树中可将这63株RA分为4个亚群,不同国家和地区的RA株在亚群中没有显示地域或时间特征,而是呈现出了互相交叉的现象,RA的OmpA差异与血清型、分离时间和分离地点没有必然的联系,本试验近期分离的8个RA株分布在2个亚群中。     

长毛兔和獭兔IFN-γ基因的克隆与真核表达及表达产物的生物学活性

为扩增长毛兔和獭兔IFN-γ基因及检测其真核表达重组体的生物学活性,采用RT-PCR法从德系安哥拉长毛兔和白色獭兔外周血淋巴细胞总RNA中扩增了IFN-γ基因,测序并序列分析;将该基因亚克隆入pVAX1载体,转染COS-7细胞,MTT法检测其生物学活性。结果表明,长毛兔和獭兔IFN-γ基因大小均为504 bp,两序列间仅在492位存在1个碱基的变异(A→T)。两序列推导的氨基酸序列相同,含167个氨基酸残基。长毛兔和獭兔IFN-γ核苷酸同源性为99.8%,与国内外学者报道的兔IFN-γ核苷酸同源性分别为100.0%和99.8%。基于NJ法构建的进化树发现,国内外学者所报道兔的不同品种均聚类在一起。通过脂质体法转染COS-7细胞,获得具有一定生物学活性的IFN-γ蛋白。结果表明,不同兔品种的IFN-γ基因间差异极小,具有较近的亲缘关系;且pVAX1-IFN-γ转染细胞后能表达具有生物学活性的蛋白。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

猪源鹦鹉热衣原体外膜主蛋白编码基因的克隆和序列测定

运用PCR技术扩增3株猪源鹦鹉热衣原体的外膜主蛋白(MOMP)编码基因,将扩增产物连接到pMD 18-T载体克隆,经酶切鉴定、PCR鉴定并分析其序列,3菌株的MOMP核苷酸序列的同源性为98.4%～99.0%,氨基酸序列的同源性为97.5%～98.1%,他们之间的差异很小,属于同一血清型.与国外发表的GPIC株及Mn株的MOMP比较,核苷酸序列的同源性分别为79.5%～80.4%和70.9%～71.3%.氨基酸序列的同源性分别为84.2%～84.7%和80.2%～80.5%.同时发现3菌株与GPIC株具有相似的基因可变区,而与Mn株的差异较大.     

鸭坦布苏病毒AH-F10株全基因组的分子克隆与序列分析

为了解鸭坦布苏病毒安徽分离株AH-F10的分子特征,利用RT-PCR方法对其全基因组序列进行了克隆,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与参考毒株进行序列比对及系统进化分析。结果显示,毒株AH-F10的全基因组序列长10 990nt,含有1个大的阅读框架,两侧各有一个非编码区(Untranslation region,UTR)。序列比对结果表明,AH-F10株与13株参考毒株的基因编码区具有较高的氨基酸序列同源性,其中与江苏JS2010株的同源性最高,达98%。研究还发现,鸭坦布苏病毒各分离株的5′UTR的序列表现一定程度的变异,AH-F10株与参考株的核苷酸序列同源性在94%~97%之间。此研究结果为进一步了解鸭坦布苏病毒的遗传变异及构建该病毒的反向遗传学操作系统奠定了基础。     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。     

猪细小病毒YK株NS1基因的克隆与序列分析

提取猪细小病毒(PPV)YK株基因组DNA,利用PCR技术扩增得到了NS1基因全序列,将其克隆到pMD18-T质粒载体并进行了序列测定和分析。结果表明,NS1基因全长1989bp,编码662个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中起重要作用的保守基序GKRN,并有3个潜在的糖基化位点NISN、NFSN和NLTR。PPVYK株的NS1基因与其他PPV毒株NADL-2(4973)株、NADL-2(5075)株、NADL-2(5034)株和Kresse株相比,核苷酸同源性分别为98.3%、99.9%、99.9%和99.7%,氨基酸同源性分别为99.7%、99.7%、99.7%和97.7%。结果说明,NS1基因具有高度保守性。     

樱桃谷肉鸭源细小病毒QH-L01株的分离鉴定及VP1基因序列分析

2016年4月,四川邛崃某鸭场送检30只樱桃谷肉鸭,临床表现鸭喙变短、舌头伸出。从送检鸭脏器中分离鉴定出1株鸭源细小病毒,命名为QH-L01株。为进一步了解该病毒毒力及分子生物学特性,对其进行ELD50测定、VP1基因测序,并与其他细小病毒毒株进行比较。ELD50测定结果为10-6.54ELD50/0.2 m L;VP1核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,该病毒结构基因全长2 203 bp,编码734个氨基酸,与鹅细小病毒核苷酸同源性为92.8%~99.8%,与番鸭细小病毒同源性为77.4%~87.3%;VP1编码的氨基酸同源性和鹅细小病毒及番鸭细小病毒分别为95.2%~99.5%和85.4%~91.1%。VP1基因进化分析显示,该病毒和鹅细小病毒SYG26-35分离株处于同一进化分支上。动物回归试验结果显示,试验组出现明显的鸭源细小病毒BADS症状,对照组无明显变化,表明该病毒分离鉴定成功。