犬冠状病毒压力灭活苗的制备与应用研究

使用静水压高压灭活的方法制备犬冠状病毒(CCV)蜂胶佐剂灭活苗,将此灭活苗免疫接种易感犬,同时以CCV甲醛灭活苗作对比试验.结果表明,CCV压力灭活苗安全可靠,其诱导试验犬产生中和抗体的能力明显高于该病毒的甲醛灭活苗,临床应用证明该灭活苗可以控制犬冠状病毒性肠炎的发生与流行.     

犬冠状病毒YS1株的致弱驯化与免疫试验

应用猫肾传代细胞(CRFK)单层接毒方法将犬冠状病毒(CCV)强毒YS1株连续传代驯化至60代,经安全性试验和免疫原性测定,该强毒株己驯化至弱毒水平,对犬安全,免度原性良好.     

鸡减蛋综合征诊断抗原与超免疫血清的研制

将鸡减蛋综合征(EDS)种毒AV-127、AV-HS-1接种鸭胚,孵育120 h后,收取尿囊液测定其血凝(HA)效价,加体积分数0.2%甲醛灭活作为诊断抗原;将病毒对鸡、兔进行3次免疫,当抗体效价达到29以上时分离血清,制备成超免疫血清.试验证明,该EDS诊断抗原和超免疫血清具有特异性强、敏感性高等特点,可用于感染鸡群的疫情调查、免疫鸡群的抗体水平监测、EDS的预防、治疗和对减蛋综合征病毒(EDSV)进行深入研究.     

H9型禽流感毒株免疫对H5型禽流感抗体检测的干扰试验

利用禽流感病毒(AIV)美国H9型毒株、江门H9型毒株和广东某厂家生产的含AIV毒株的几种禽用商品疫苗分别免疫40日龄的肉用鸡.通过首免和超免疫后采集首免血和超免疫血分离血清,分别用自制H5型抗原(美国毒株)、广州H5型抗原(香港毒株)和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所H5型抗原对上述免疫鸡血清进行血凝抑制试验(HI),测定这些H9型毒株免疫的抗血清对H5型抗体检测的影响.试验结果表明,单纯的H9型毒株免疫的抗血清不构成对H5型抗体检测的影响.而含AIV抗原的商品疫苗免疫的鸡血清部分显示H5型抗体阳性,说明某些商品疫苗中含H5型抗原.用美国H5型毒株免疫的鸡血清进行反向验证试验,也未发现对H9型抗体检测的影响,表明H5和H9型AIV不存在同源抗原,因而在二者抗体检测中不存在相互干扰的问题.     

CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列、犬细小病毒(CPV)VP2基因序列和犬冠状病毒(CCV)M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV(193 bp)、CDV(500 bp)和CCV(780bp)的多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

隐孢子虫病抗体治疗的研究进展

从超免疫初乳、超免疫血清、超免疫卵黄和单克隆抗体几个方面概述了国内外隐孢子虫病抗体治疗的研究现状,并介绍了预防隐孢子虫病疫苗的研究成果,为进一步防治该病提供了参考.     

鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立

本研究针对野毒株与疫苗株的H基因设计特异性引物,通过优化反应体系和反应程序,建立了一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法。检测结果表明,该方法能特异性地检测CDV野毒株,与CDV疫苗株、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒和犬副流感病毒均无交叉反应。其标准曲线的相关系数达0.987。检出敏感性达6.22×101copes/L,比常规PCR检测方法高100倍。应用本方法检测了42份临床疑似CD样品,其中41份为野毒株感染,随机选取15份阳性样本进行H基因克隆测序,通过进化树分析显示它们均属于Asia-Ⅰ型,与疫苗株H基因相比同源性较低,核苷酸的同源性在90.3%~91.3%之间,氨基酸同源性在96.3%~97.2%之间。该方法的建立为临床上CDV的鉴别检测提供了依据。     

鸡传染性喉气管炎病毒的荧光抗体检测

建立了一种鸡传染性喉气管炎 (ILT)的荧光抗体检测技术 ,用荧光素标记ILT兔源超免疫血清抗体 ,对 15份人工感染ILT病鸡、5份ND病鸡和 10份健康鸡的气管分泌物进行了检测 ,并对该技术做了特异性和敏感性测定。结果显示 ,人工感染ILT病鸡的阳性检出率高达10 0 % ,ND病鸡和健康鸡的阳性检出率均为 0 ;该ILT兔源超免疫血清荧光抗体检测技术特异性强、敏感性高     

黑龙江省鸭肝炎病毒HD-Ⅰ株的分离与鉴定

从黑龙江省某鸭场疑似鸭病毒性肝炎 (DVH )的发病雏鸭肝等组织中分离到 1株病毒HD Ⅰ株。经病理学检查、电镜观察、鸭胚中和试验、雏鸭保护试验、动物回归试验等鉴定为血清Ⅰ型鸭肝炎病毒 (DHV)。证实引起该鸭场雏鸭发病和死亡的主要原因为DVH所致。用DHV标准R85 95 2毒株多次强化免疫健康鸡 ,获得高效价的鸡抗鸭肝炎超免疫抗体。     

犬细小病毒兰州分离株VP2基因的克隆及进化树分析

本研究首次对地处西北地区的兰州的犬细小病毒分离株(命名为CPV/LZ-kbz11)进行了VP2基因克隆、测序,并与参考株、我国各地区流行株以及周边国家流行株进行了进化树分析和核苷酸同源性比较。结果显示,该毒株能在犬肾细胞系(MDCK)上成功生长,但不引起细胞病变。该分离株为CPV-2b亚型毒株,与M19296(CPV-2亚型参考毒株)、EU659118(CPV-2a亚型参考毒株)、EU145954(CPV-2b亚型参考毒株)、AB054224(CPV-2c亚型参考毒株)的核苷酸序列同源性分别为99.0%、99.3%、99.2%、99.2%;与我国及周边主要流行毒株EU213079(CPV-2a,浙江)、EF666059(CPV-2a,北京)、EF599096(CPV-2a,韩国)、EF592511(CPV-2a,台湾)、EU483512(CPV-2b,浙江)、FJ222821(CPV-2c,意大利)的核苷酸同源性分别为99.6%、99.5%、99.4%、99.4%、99.4%、99.4%。对VP2基因中非同义置换的氨基酸分析结果显示,兰州分离株与对比毒株的非同义突变位点共有4处,分别在第267位、324位、426位和440位的氨基酸处。     

成都动物园野生动物原虫和犬恶丝虫的感染情况调查

对2006～2008年先后采集自成都动物园30种177只野生动物的血样进行了弓形虫、犬新孢子虫和犬恶丝虫血清抗体的检测.结果显示,弓形虫抗体阳性率为47.46%(84/177);犬新孢子虫抗体阳性率为10.74%(19/177);犬恶丝虫抗体阳性率为2.26%(4/177).同时,对该动物园30种187只野生动物的血样进行了血液涂片染色镜检,附红细胞体检出率为35.83%(67/187),在血涂片中未查出伊氏锥虫.     

口蹄疫超免疫血清的制备

超免疫血清 (ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅｓｅｒｕｍ )是一种含有高效价特异性抗体的动物血清。口蹄疫 (ＦＭＤ)超免疫血清是采用口蹄疫病毒(ＦＭＤＶ)佐剂抗原作免疫原 ,通过逐次增大抗原含量多次免疫豚鼠 ,使豚鼠不断产生免疫应答 ,从而获得抗ＦＭＤＶ的高效价特异性抗体血清。该血清主要用于ＦＭＤ的中和试验、补体结合试验 ,也可用来生产诊断制剂 ,用于ＦＭＤＶ型的鉴定及易感动物的被动免疫。　　我们通过试验 ,以ＦＭＤＶ和弗氏不完全佐剂制备抗原结合物免疫豚鼠 ,定期采血 ,用补体结合试验监测抗体水平 ,使ＦＭＤ超免疫血清效价达到 1∶1…     

珠江三角洲及其附近地区鸭肝炎流行动态调查

调查了珠江三角洲地区近20个县、市鸭肝炎(DH)的流行情况、临床表现、病理变化和免疫防制现状.从本调查的结果可见,该地区DH多发区的雏鸭以7～21日龄发病最多,最早的2～3日龄,最迟的在樱桃谷鸭及其改良品种可见于35日龄,在番鸭可见于60～70日龄,个别番鸭在200日龄还有零星发病.3～14日龄发病的雏鸭死亡率在60%～95%,15～35日龄发病的死亡率在15%～40%,35～70日龄发病的死亡率在5%～15%,更大日龄发病的死亡率在5%以下.根据防治效果,许多用标准DHV-Ⅰ型弱毒疫苗免疫的鸭群,或在发病初期注射标准DHV-Ⅰ型超免疫卵黄抗体的鸭群,其疫情还不能控制,往往需在发病初期用本地病鸭分离的DHV作疫苗,进而制备超免疫卵黄抗体及时治疗,才能将鸭群的死亡率控制在2%～8%.提示该地区原来流行的DHV-Ⅰ型野毒株有可能发生抗原毒力变异或已传入DHV-Ⅱ型或DHV-Ⅲ型.     

新城疫病毒F48 E9株M和NP基因的原核表达

根据新城疫病毒(NDV)F48E9国内标准强毒株编码序列设计了2对特异性引物,分别用于扩增M和NP基因.经序列测定,将其克隆到原核表达载体pET-30a( )上,转化E.coli BL21(DE3),筛选表达NDV F48E9株M蛋白和NP蛋白的菌株.IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果表明,NDV M蛋白在E.coli BL21(DE3)内以可溶形式存在,而NP蛋白以包涵体的形式表达.用纯化的M和NP蛋白免疫鸡制备超免疫血清,进行Western-blot分析;结果,它们可以与真核表达系统表达的M和NP蛋白以及NDV发生特异性反应,表明,原核表达系统表达的NDV M和NP蛋白具有良好的免疫原性和反应原性.     

犬细小病毒广西流行株的分离鉴定及生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒广西地方毒株的生物学特性,本研究收集广西各地疑似犬细小病毒(CPV)感染病犬的粪便通过接种F81细胞进行病毒的分离培养,并通过血凝试验、抗性分析、同源性分析和攻毒试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,接种3代后,细胞出现明显的病变(CPE),血凝效价为1∶512,第5代病毒的TCID_(50)为1×10~(-3.6)/0.1 m L,能抗热、酸、氯仿和乙醚;电镜观察到CPV为直径约25 nm圆形、无囊膜的结构,应用CPV特异性引物检测到长约1 419 bp和1 254 bp的特异性条带,提示成功分离到一株犬细小病毒毒株;测序分析结果表明,VP2基因与周边国家地区及我国各地方的参考毒株、流行株核苷酸同源性为98.9%~99.8%;系统进化发生分析表明,广西分离株的基因型为CPV-2a亚型,与泰国参考毒株VT148亲缘关系最近;与其它CPV-2a亚型相比,分离株的第267位、305位、324位和440位氨基酸位点发生了变异;动物回归试验结果表明,犬细小病毒广西分离株属于强毒株。本研究成功分离到犬细小病毒广西地方流行株,并对其主要衣壳蛋白VP2基因进行遗传变异分析,为更好的预防和控制犬细小病毒提供依据。     

用牛驴羊制备鸡新城疫和传染性腔上囊病二联超免疫血清的方法比较及临床应用效果

对牛、驴、羊用不同的新城疫( ND) 、传染性腔上囊病(IBD) 疫苗多次免疫,在ND HI 抗体和IBD AGB 抗体达到要求后采血,制备ND、IBD 二联超免疫血清。该抗血清对人工感染NDV 和IBDV 强毒的2 周龄雏鸡有较强的保护力。在现场对2 万多只鸡应用,有效率在95 % 以上。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

犬瘟热病毒昆明分离株的生物学特性

从1只曾接种过犬瘟热弱毒疫苗但又发病的宠物犬血样中分离到1株犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV昆明分离株(CDV-KM)。该毒株可使Vero细胞产生以细胞融合及空泡化为特征的细胞病变,病毒效价为105.8TCID50/mL或1.76×106PFU/mL,并能在鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚成纤维细胞及MDCK细胞上增殖。微量中和试验结果发现,自制的犬抗CDV-KM株同份血清对CDV-KM株与参考毒株CDV-Onder-stepoort的中和抗体效价即半数保护量分别为1:142和1:132,显示二者未存在明显的中和表位差异。RT-PCR、RFLP和DNA测序分析结果显示,使用参照组合引物CDV-P2/P3/P4扩增,均可得到被认为指示弱毒株特征的177bp核酸片段;而H蛋白全长基因扩增产物未见能指示野生毒株特征的NdeⅠ和SspⅠ酶切位点;H蛋白基因与Onderstepoort小空斑变异株、鸡胚适应株和大空斑变异株的核酸序列同源性分别为98.84%、98.90%和100%。表明该分离株属于疫苗基因群。