布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建

选择含有反向筛选基因sacB标记的pRE112质粒为自杀载体,利用等位基因交换的方法成功敲除了布鲁氏菌弱毒疫苗S19株、S2株、M5株的bp26基因,构建了具有非抗性基因标记的缺失株S19-Δbp26、S2-Δbp26、M5-Δbp26。将构建的重组自杀质粒pRE-Δbp26(缺失了bp26基因的681个碱基)电转化入布鲁氏菌后,经过5μg/mL氯霉素筛选单交换子和70g/L蔗糖筛选同源重组双交换子,用菌落PCR及DNA测序的方法进行验证。结果表明,bp26基因的缺失改造成功,连续传20代后菌落PCR及DNA测序的结果显示突变株具有遗传稳定性。以pRE112自杀质粒为基础构建无抗性基因标记的布鲁氏菌缺失株为布鲁氏菌的基因功能研究奠定了基础,同时Δbp26缺失株的构建可为新型布鲁氏菌疫苗的研制奠定基础。     

维氏气单胞菌rpoN基因缺失株的构建及部分生物学特性分析

为了研究rpoN基因对维氏气单胞菌致病性的影响,采用同源重组的方法构建该基因缺失株。以该菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增rpoN基因的上、下游同源臂;以上、下游同源臂胶回收产物为模板,P1-1/P2-2为引物进行重叠PCR扩增相应目的片段,从而获得rpoN上下游同源臂连接片段;将获取的连接片段连接pRE112,将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取重组质粒pRE112-rpoN,经同源重组和抗生素筛选获得维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN。同时,依然利用重叠PCR将目的基因片段与启动子相连接,而后与质粒p BBR-MCS相连接,最后将重组质粒pBBR-MCS-rpoN转化至缺失株ΔrpoN中,构建互补株C-rpoN。PCR鉴定和测序结果显示,成功构建出维氏气单胞菌rpoN基因缺失株ΔrpoN和互补株C-rpoN。生物学特性分析试验结果表明rpoN的缺失导致维氏气单胞菌TH0426菌落形态改变、生物被膜形成能力下降、动物致病性减弱,鞭毛断裂,运动性丧失。本研究中成功构建了维氏气单胞菌TH0426株rpoN基因的缺失株ΔrpoN,为进一步研究维氏气单胞菌减毒疫苗和rpoN基因的功能奠定了基础。     

表达牛分枝杆菌esat-6和cfp-10基因的重组流产布氏杆菌S19疫苗株的构建及毒力评估

通过overlap PCR扩增了含有bp26基因上游片段、bp26基因下游片段及牛分枝杆菌esat6-cfp10基因的目的片段Δbp26-ec,利用含有sacB基因的自杀质粒pRE112为载体,通过等位基因交换的方法,将构建好的自杀质粒电转入已经构建好的缺失bp26基因的流产布氏杆菌减毒活疫苗S19突变株中,构建了具有非抗性基因标记的突变株S19-Δbp26-ec,并对构建好的新型基因突变株进行了生物学特性及毒力的鉴定及分析。PCR及核苷酸序列测序结果显示,S19-Δbp26-ec构建成功。与亲本株相比,疫苗株S19-Δbp26-ec的生长特性没有显著性差异;体外连续传至20代后,菌落PCR和核苷酸测序结果显示,S19-Δbp26-ec株具有良好的遗传稳定性。被感染小鼠脾重和脾中菌落数表明,S19-Δbp26-ec的毒力最弱,S19和S19-Δbp26次之。上述结果表明,本试验获得了毒力减弱的基因突变株S19-Δbp26-ec,为牛布氏杆菌病-结核病二联疫苗的研制奠定了基础。     

浙江省副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

从浙江省5个县(区、市)疑似患有多发性浆膜炎和关节炎猪的98份病料中分离到26株细菌,通过细菌形态、培养特性和生化特性观察以及PCR鉴定最终确定为副猪嗜血杆菌。对26株已确定为副猪嗜血杆菌的分离株进行了血清学分型和药敏试验。结果显示,分离到的26株副猪嗜血杆菌分离株中,4型8株,5型6株,12型5株,13型2株,其余5株无法分型,并且副猪嗜血杆菌对头孢类药物、氟喹诺酮类药物及庆大霉素敏感,对复方磺胺类药物、大环内酯类抗生素及氯霉素敏感性略有不同,对四环素、氨苄青霉素具有耐药性。试验结果对浙江省猪场副猪嗜血杆菌病的防治提供了指导依据。     

鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为了探究5'-nucleotidase基因的功能及其在鼠伤寒沙门菌感染中的作用,本研究首先构建缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因的重组自杀性质粒pR E 112Δ5'-nucleotidase,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选出SL1344Δ5'-nucleotidase缺失株,并对其生物学特性进行初步研究。PCR及测序结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase构建成功,且回复株SL1344CΔ5'-nucleotidase构建成功。进一步研究表明,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失1 112 bp的5'-nucleotidase基因,生长速度没有发生明显改变。但是,缺失株SL1344Δ5'-nucleotidase口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为4.30×10~7CF U,毒力降低至亲本株SL1344的1.96%。免疫保护率试验结果显示,对6周龄BALB/c小鼠免疫后第17天,鼠伤寒沙门菌野生株攻毒有50%的保护率。缺失株免疫小鼠后第21天,血清抗体IgG水平达到最高。回复菌株与亲本亲株之间生物学特性无显著性差异,基本恢复到野生型水平。上述结果表明,SL1344Δ5'-nucleotidase基因缺失株构建成功,遗传稳定,毒力明显降低,且具有较好的免疫原性,为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因与其致病力之间的关系提供了依据,并为研究它在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定了基础。     

鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

为研究sifA基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用λ-red同源重组系统构建鸡白痢沙门菌S06004株的sifA基因缺失株S06004ΔsifA,同时构建该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA),并对该缺失株的生长特性、生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性进行了研究。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了sifA基因缺失株S06004ΔsifA和该基因缺失株的回补株S06004ΔsifA(pBR322-sifA);生物学特性研究结果显示,sifA基因的缺失不影响鸡白痢沙门菌的生长特性和生化特性,且该缺失株具有良好的遗传稳定性,但其对3日龄雏鸡的LD50升高了39.3倍。本研究获得的减毒鸡白痢沙门菌sifA基因缺失株S06004ΔsifA为进一步研究鸡白痢沙门菌sifA基因的功能奠定了基础。     

鸭疫里氏杆菌CH3株ompA基因缺失株的构建及其部分生物学特性的研究

为了分析OmpA缺失对鸭疫里氏杆菌生物学特性的影响,采用自杀质粒同源重组的方法构建了CH3株的ompA基因缺失株。用PCR方法扩增ompA基因左右两侧的同源臂和壮观霉素抗性基因表达盒后连入自杀性质粒pDS132,构建得到重组自杀质粒pDS132-ompA-LSR。再通过双亲本接合转导的方法将此重组质粒导入到CH3株,用含卡那霉素和壮观霉素的TSA筛选可能的基因缺失株,并用PCR和Western-blot进行鉴定,获得基因缺失株CH3ΔompA。生物学特性分析表明,OmpA缺失后鸭疫里氏杆菌对盐离子浓度的耐受能力降低、对抗生素的敏感性增强,而对去污剂SDS、EDTA和酸碱(pH)耐受性没有明显的影响。     

三株胸膜肺炎放线杆菌基因缺失株免疫原性的研究

为深入研究猪传染性胸膜肺炎基因工程弱毒活疫苗的生物学特性和免疫原性,分别以本实验室构建的血清7型胸膜肺炎放线杆菌(APP)基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和血清5型APP的基因缺失株SW1ΔⅠC为研究对象,对其进行研究。溶血活性试验证实,突变株完全失去了溶血活性。细胞毒性试验证实,缺失株SW1ΔⅠC的细胞毒性完全丧失,缺失株apxⅡC-/Kan+和apxⅡC-/ⅠN+有轻微的细胞毒性。遗传稳定性试验证实,3株缺失株在体内传5代均不会发生回复突变。毒力试验结果显示,基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1ΔⅠC对小鼠的半数致死量分别为亲本株的5倍、7倍和15倍。3株缺失株分别免疫小鼠后,以10LD50血清1型、5型和7型APP的剂量攻毒,小鼠的保护率可达100%。试验结果表明,3株缺失株的毒力明显降低,并能提供有效的保护力。本研究为进一步以突变株为基因工程弱毒活疫苗的研究奠定了一定基础。     

猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体系统的构建及生物学特性研究

为开发减毒猪霍乱沙门氏菌的活疫苗载体,通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建了猪霍乱沙门氏菌C78-1株ΔcrpΔasd双基因缺失株,并对其生物学特性进行探讨。首先构建含有缺失1 488bp asd基因的重组自杀性质粒pREΔasd,然后与已构建完成的ΔcrpC78-1缺失株进行接合转移,采用两步法筛选无抗性的C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株。PCR鉴定结果表明,C78-1的ΔcrpΔasd双缺失株构建成功;进一步研究表明,该缺失株的生长需要外源的二氨基庚二酸(DAP),且能稳定遗传缺失的asd基因,与C78-1相比,其血清型未发生变化,但其生长速度明显减慢。ΔcrpΔasd C78-1双缺失株可接受asd+质粒作为宿主平衡致死系统高效稳定地表达外源基因,为开发以C78-1为载体的口服多价疫苗奠定了基础。     

维氏气单胞菌TH0426株ndk基因缺失株的构建与生物学特性分析

为研究维氏气单胞菌ndk基因的功能,利用自杀性质粒pRE112通过同源重组的方法缺失ndk基因,然后对野生株和缺失株的生长能力、运动性、生物被膜形成能力及LD50等进行差异分析。经过PCR以及荧光定量PCR表达水平证明ndk基因缺失成功;生物学特性研究显示,缺失株的生长能力和泳动性均下降;生物被膜形成能力与野生株相比差异极显著(P0.001);与野生株相比,LD50升高了5.5倍,且差异极显著(P0.001)。由此可以推测,ndk基因与维氏气单胞菌的毒力及生物被膜形成密切相关。本研究结果为维氏气单胞菌致病机制的研究奠定了基础。     

鸡白痢沙门菌S06004ΔspiC突变株的构建与鉴定

为了研究spiC基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,采用同源重组方法构建该基因缺失株。以鸡白痢沙门菌S06004基因组DNA为模板,PCR扩增spiC基因上、下游DNA片段作为等位基因;将上游片段、卡那霉素抗性基因(KmR)及下游片段依次连接并克隆到pGMB151自杀性质粒上,构建重组自杀质粒pGMB151-ΔspiC/KmR,通过大肠杆菌χ7213与鸡白痢沙门菌S06004固相杂交,将质粒转入S06004中,运用反向筛选法获得含KmR基因的spiC基因缺失株(ΔspiC/KmR);再使用编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20敲除KmR,获得无抗性ΔspiC。PCR鉴定和测序结果显示,spiC基因被成功缺失。血清型、生化特性、生长特性、耐药性等鉴定表明,S06004ΔspiC未发生理化特性改变。本研究成功构建了spiC基因缺失株S06004ΔspiC,为进一步研究鸡白痢沙门菌致病性变化及spiC基因的功能奠定了重要基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株分泌性蛋白K1缺失株的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)疫苗弱毒株,本研究首先构建了含缺失1 011 bp sseK1基因的重组自杀性质粒PREΔsseK1,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的sseK1缺失株。PCR、双酶切及测序结果表明SL1344ΔsseK1构建成功。生物学特性初步研究表明,与亲本菌株SL1344相比,缺失株SL1344ΔsseK1保留了亲本株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK1基因,生长速度及生化特性没有发生明显改变。小鼠毒力试验表明,SL1344ΔsseK1缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD_(50)为6.63×10~8CFU,毒力较亲本株SL1344下降至0.048%。免疫保护效力试验显示,小鼠免疫后第14天血清抗体Ig G含量达到最高,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率。以上研究结果表明,SL1344株sseK1基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为研究sseK1基因的致病机制及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础。     

鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp的构建及鉴定

为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒株,首先利用自杀质粒介导的同源重组技术构建鸡伤寒沙门菌1009株的spic基因缺失株1009Δspic,在此基础上,运用λ噬菌体同源重组系统进一步敲除crp基因,以构建鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建出双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。生物学特性研究结果显示,1009株spic和crp基因的缺失能够得到稳定的遗传,部分生化特性发生了变化,生长速度较缓慢,对雏鸡的LD50升高了107倍。本研究获得的高度安全的鸡伤寒沙门菌减毒株为进一步研制鸡伤寒沙门菌减毒疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗候选株,在单缺失株SL1344Δcrp的基础上,运用自杀性质粒介导的细菌同源重组技术敲除sipB基因,构建了双缺失株SL1344ΔcrpΔsipB。PCR及测序结果表明SL1344ΔcrpΔsipB构建成功。生物学特性研究表明,SL1344ΔcrpΔsipB血清型未发生变化,遗传性稳定。与亲本株SL1344相比,双缺失株的生长速度明显减慢,毒力降低了约99.9%以上。免疫保护效力试验显示,6周龄昆明小鼠口服免疫SL1344ΔcrpΔsipB后第17天,利用鼠伤寒沙门菌野生株攻毒,保护率为60%;免疫后第21天血清抗体效价达到峰值。上述结果为进一步研制安全有效的鼠伤寒沙门菌疫苗弱毒株奠定了基础。     

减毒鸡白痢沙门氏菌ΔcrpC79-13株的构建及其对雏鸡的免疫活性

为构建鸡白痢沙门氏菌C79-13株Δcrp基因缺失突变株,并初步观察ΔcrpC79-13缺失菌株作为活疫苗对雏鸡的免疫活性,将含缺失320bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp与C79-13进行接合转移,两步法筛选出无抗性标记的ΔcrpC79-13缺失菌株;通过半数致死量测定其毒力;给4日龄雏鸡口服免疫缺失菌株,在不同时间点根据胸腺、法氏囊、脾等免疫器官发育和平均日增重、外周血淋巴细胞转化试验、Griess法NO测定及血清IgG动态观察免疫水平。结果显示ΔcrpC79-13的毒力较C79-13降低约99.6%(LD50>5.0×109CFU);雏鸡接种ΔcrpC79-13(1.0×109 CFU/只)后不影响雏鸡生长,第14～21天体内特异性细胞和体液免疫水平达到最高。表明成功构建了减毒鸡白痢沙门氏菌ΔcrpC79-13株,其毒力显著降低,免疫雏鸡安全,具有良好的免疫活性。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp基因缺失株的构建及其部分生物学特性分析

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的致病机制,在全基因测序的基础上,通过同源重组缺失脂蛋白基因。首先扩增脂蛋白基因的上下游同源臂,通过重叠PCR连接后,凝胶回收DNA片段;连接克隆载体pMD18-T,转化DH5α感受态细胞,测序成功后提取质粒进行双酶切,连入相同酶切的Pre112自杀性质粒;依次转化DH5α-λpir、WM3064感受态细胞,作为供体菌;和受体菌野生株进行同源重组,并筛选鉴定。结果显示,成功缺失了维氏气单胞菌脂蛋白基因。生物学特性分析结果发现,缺失株和野生株的生长速度相似,生物膜形成能力降低,鞭毛缺失,游动能力减弱,细菌的毒力降低,溶血活性没有明显变化。因此,成功构建了维氏气单胞菌脂蛋白基因缺失株,并分析了其部分生物学特性,为进一步研究脂蛋白基因的功能奠定了一定的基础。     

副猪嗜血杆菌纳米PCR检测方法的建立

为了建立副猪嗜血杆菌(HPs)的高效纳米PCR检测技术,根据文献合成了1对针对HPs的16S rRNA基因的特异性引物,并对纳米PCR的反应条件进行优化。然后用建立的纳米PCR检测HPs、大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌及猪链球菌2型等猪源细菌以验证该纳米PCR的特异性,同时比较该纳米PCR与普通PCR的灵敏度。特异性试验结果表明,只有HPs能够扩增出822bp的目的片段,其他细菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,建立的纳米PCR的敏感性比普通PCR高10倍,最低可检出4.19×10-6 ng/μL的HPs基因组DNA。结果表明,本研究建立的基于16S rRNA基因的HPs纳米PCR具有较好的特异性和较高的灵敏度,是一种高效、快速的检测方法,可为副猪嗜血杆菌病的防控和检验检疫提供技术支撑。     

维氏气单胞菌脂蛋白Lpp/LppB双基因缺失株的构建与验证

在维氏气单胞菌单基因缺失株ΔLpp的基础上,通过同源重组方法获得脂蛋白LppB基因上、下游同源臂连接片段,依次构建重组克隆载体pMD18-T-L-UD1225和重组自杀性载体Pre112-L-UD1225,随后转入WM3064感受态细胞中作为供体菌,与受体菌ΔLpp进行结合转移,构建双基因缺失株ΔLpp/LppB,通过反转录验证并检测其遗传稳定性。结果显示,成功构建了遗传稳定性良好的双基因缺失株ΔLpp/LppB,其生长速率和生物被膜形成能力较野生株WT均下降。结果表明,协同缺失脂蛋白基因Lpp和LppB后,双基因缺失株ΔLpp/LppB的生长和生物被膜变化更显著,这有利于进一步推测脂蛋白基因的功能,为之后研究维氏气单胞菌的致病机制奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌部分体内诱导基因的筛选

用Sau3AⅠ酶切副猪嗜血杆菌(HPS)SC-1株基因组,回收500～2000bp的片段,并与pRSETa/b/c载体连接,构建了HPSSC-1株基因组表达文库;将攻毒后不同时间的猪血清混合,分别与体外培养的HPSSC-1和大肠杆菌BL21的全菌、超声裂解产物及热变性裂解产物进行吸附,用ELISA检测吸附效果,并用Western-blot进一步验证;再用经过吸附的混合血清对HPSSC-1基因组表达文库进行菌落原位免疫杂交筛选;对筛选出来的阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果显示,构建的副猪嗜血杆菌基因组文库库容量为1.2×104CFU;混合血清经过吸附后,D450nm由0.384下降到0.220。Western-blot结果显示,经吸附的血清与HPSSC-1株超声裂解产物无任何条带;通过原位免疫印迹筛选获得5个阳性克隆;阳性克隆测序结果经DNAMAN分析初步推测出5个可能具有生物学意义的开放阅读框,BLAST分析表明,这些序列与GenBank中的副猪嗜血杆菌相应基因的同源性在99%以上,分别涉及副猪嗜血杆菌的酪氨酸磷酸酯酶、异亮氨酰-tRNA合成酶、荚膜多糖输出蛋白及2个假定蛋白。结果表明,应用体内诱导抗原技术从副猪嗜血杆菌SC-1株基因组表达文库中成功筛选出5个阳性克隆,其中部分基因可能与毒力相关。