猫华支睾吸虫异位寄生

为了摸清我区华支睾吸虫病的流行情况,以及人畜间的传染关系,我所与上高县血防站在华支睾吸虫流行区进行了一次调查,发现家猫感染本病较为严重。 (一)临床资料 先将猫吊死,剖腹后取肝、胆、脾、肾、肠管、胃、心、肺部组织及脑组织压片镜检,另抽胆汁进行虫卵计数。在每只猫体内发现的成虫全部收集并加以鉴别。 共剖检3只家猫,均发现华支睾吸虫的成虫与虫卵,其中1只有绦虫寄生。其肝脏均有不同程度的肿大,肠粘膜有不同程度的损害。其中1只猫病     

ABC-Dot-ELISA检测家兔抗华支睾吸虫IgG

免疫酶斑点试验(Do t-ELISA)检测抗体,具有敏感、简便等优点,因此,近年来被用于检测多种寄生虫抗原和抗寄生虫抗体。笔者利用亲和素-生物素(Avidin-Biotin)的生物放大作用,将Avidin Biotin-HRP Complex(ABC)与Dot-ELISA结合,建立了ABC-Dot-ELISA,用于检测人工感染华支睾吸虫家兔血清中的特异性IgG,同时做ABC-RLISA进行比较。(一)材料和方法1.抗原制备:按常规方法进行,蛋白质含量为5 mg/ml。2.生物素化羊抗兔地IgG(b-SARIgG)和     

华支睾吸虫囊蚴RPA检测方法的建立

为了建立灵敏、快速的鉴别华支睾吸虫诊断方法,本研究根据华支睾吸虫囊蚴的COX-1基因序列设计引物,建立检测华支睾吸虫囊蚴的RPA方法.结果 显示:所建立的RPA的灵敏度可达到2.75 ng/μL,而与日本血吸虫、隐孢子虫、阔节裂头绦虫、东方次睾吸虫囊蚴、台湾次睾吸虫囊蚴、异尖线虫和棘颚口线虫均无交叉反应;经条件优化后,...     

湖南省华支睾吸虫线粒体cox1和nad1基因的克隆及进化分析

为了研究湖南省华支睾吸虫分离株线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因部分序列(pcox1)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚单位Ⅰ基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并用pcox1和pnad1序列构建华支睾吸虫与其他吸虫的种群遗传进化树。应用聚合酶链反应扩增华支睾吸虫虫株的pcox1和pnad1,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,然后用Phylip3.67程序中的MP法和MEGA4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle5.2程序构建最大似然树。结果显示,所获得的pcox1和pnad1序列长度分别为1 100bp和790bp,种系发育进化表分析表明,25个华支睾吸虫分离株位于同一分枝。证实华支睾吸虫pcox1和pnad1序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为种间遗传变异研究的标记,从而为华支睾吸虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定基础。     

新血防片驱除黄牛枝睾阔盘吸虫的试验报告

国产新血防片,又名“血防846”,即六氯对二甲苯。该药已应用于治疗人的血吸虫病,对驱治家畜血吸虫、肝片吸虫、华枝睾吸虫、矛形双腔吸虫等病也有不同程度的效果。动物实验提示,本药可能通过原浆毒的作用,使虫体细胞变性,引起性腺萎缩,肌肉活动功能减弱等(上海寄生虫病研究所)。 目前,国内外对防治家畜胰吸虫病尚无可靠的方法和药物。报告者之一在黑龙江省参加了崔贵文同志主持进行的应用“血防846”等药物驱除羊只胰阔盘吸虫的试验工作。试验结果说     

肝片吸虫诊断候选抗原的筛选

旨在筛选出肝片吸虫诊断候选抗原,拓展诊断肝片吸虫感染引起的肝吸虫病的靶点。通过蛋白免疫印迹试验从肝片吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库中筛选出肝片吸虫特异性抗原基因,对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。克隆特异性抗原基因,并连接表达载体pET-32a(+),构建重组质粒,转化至BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western-blot验证其表达情况。结果表明,共计获得了18个阳性克隆。通过候选抗原核酸序列同源性比较,发现肝片吸虫假定蛋白D915_000758具有完整的开放阅读框。经生物信息学分析,发现该蛋白cDNA全长为345 bp,编码114个氨基酸。成功扩增出该特异性抗原基因,SDS-PAGE结果表明重组蛋白pET-Fh以包涵体形式表达,分子质量大小约为32 ku;Western-blot证明该重组蛋白可以被肝片吸虫阳性血清特异性识别。结果提示,假定蛋白D915_000758可作为潜在的肝片吸虫病诊断候选抗原,应用于肝片吸虫感染引起的肝吸虫病的诊断技术中。     

肝片吸虫诊断抗原提纯方法的研究

用肝片吸虫成虫粗制抗原经葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)分离到4个蛋白峰,以间接血凝法(IHA)测定各峰抗原活性,除第Ⅳ峰外,其余各峰均有活性,以Ⅱ、Ⅲ两峰的特异性最强。提纯抗原能检出人工感染10～100个囊蚴14天以上的羊抗体。提纯抗原保存60个月,其效价不变。     

口蹄疫病毒12S抗原免疫学性质的研究

用口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）Ａ型１２Ｓ基础免疫，Ｏ型１２Ｓ加强免疫的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合，筛迭，得到了一组群特异性单抗。用ＲＰＨＩ，ＡＧＤ，ＥＬＩＳＡ及阻断式和竞争式ＥＬＩＳＡ分析这组单抗得出以下结论：１２Ｓ抗原至少存在一个１２Ｓ独有的型间交叉的群特异性抗原表位，该表位是非中和性抗原表位，免疫原性较低；这组群特异性单抗可与ＦＭＤＶＯ，Ａ，Ｃ，Ａｓｉａ－１型１２Ｓ发生不同程度的反应，表明该表位存在于ＦＭＤＶＯ，Ａ，Ｃ，Ａｓｉａ－１型１２Ｓ上，但不同血清型的１２Ｓ表位构成存在细微的差别     

猪旋毛虫不同发育时期虫体49 ku ES抗原基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已登录的猪旋毛虫49 ku ES抗原基因序列设计了1对引物,用SDS裂解液配合蛋白酶K方法从猪旋毛虫不同发育时期(成囊前期幼虫、肌幼虫、成虫)虫体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增49 ku ES抗原基因,将目的基因定向克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希氏菌TG1。用PCR、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ进行单、双酶切鉴定,阳性质粒的测序结果表明,成功克隆了猪旋毛虫不同发育时期虫体49 ku ES抗原基因。序列分析结果显示:49 kuES抗原基因大小为948 bp,基因的保守性很强,序列同源性比较高,不同发育时期之间的差异很小。     

多头绦虫抗原特性的研究（1）——囊液和囊壁粗抗原的免疫原性

用羊脑多头蚴囊液和囊壁粗抗原以１２ｍｇ／只的免疫剂量与等体积的白油－司班佐剂乳化，分３次免疫羊。于第３次免疫后１４ｄ，经口攻击感染多头绦虫虫卵２５００枚，攻击后２２５ｄ，剖杀检查免疫效果。结果囊壁粗抗原免疫组羊只全获保护，囊液粗抗原免疫组羊只（３／４）获保护，另１只羊脑中有直径０．６ｃｍ钙化的多头蚴病灶，其间为干酪样物质。而感染对照组羊脑中均有多头蚴寄生，其中１只羊脑中有３个多头蚴包囊，致使羊的脑组织极度萎缩，呈一层薄膜包围在包囊周围。免疫羊血清抗体滴度与免疫保护力之间呈正相关关系，免疫羊体重略高于对照羊     

鸡后口吸虫的光镜和扫描电镜观察

笔者1987年8月从上海市金山县的鸡盲肠中检到一种吸虫,经鉴定为鸡后口吸虫(Postharmos tomum gallinum Witenbeg,1923),在对该虫体进行光镜观察的基础上,还进行了扫描电镜观察。     

猪瘟病毒复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性

为研究猪瘟病毒多表位疫苗,参照GenBank及文献中已发表的猪瘟病毒抗原表位,结合计算机分析软件进行优化和组合。将重组的多表位基因BT23人工合成克隆至pMD18-T质粒中,利用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切并回收BT23基因,将BT23基因片段亚克隆插入pGEX-6P-1表达载体中,构建了猪瘟病毒复合多表位抗原基因的原核表达质粒pGEX-BT23,经酶切和测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达。经SDS-PAGE分析,以终浓度为0.9mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达产物为融合蛋白,并且以包涵体形式存在,分子质量约36ku,表达产量约占菌体总蛋白的30%。Western-blot检测结果表明,表达的融合蛋白能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应,说明表达产物具有良好的反应原性。免疫攻毒试验结果表明,复合多表位融合蛋白具有免疫保护作用,这为应用该融合蛋白制备猪瘟病毒免疫血清学诊断试剂和多表位疫苗的研究奠定了基础。     

肝片吸虫驱虫药TrodX(Nitroxyni1)对牛羊的毒性和驱虫效果

迄今研究出的肝片吸虫驱虫药有二苯甲烷diqhenylmethane系(六氯酚)、二酚diphenol系(拜耳9015)、硫化二苯diphenvlsulfide系(硫双二氯酚、Ds-6)、苯甲醯胺Bcnzoylamide系(Hilornide、Oxyclozanide、Tremerad)和酚Phenol系(Nitroxynil、Disopheuol)等,其中在驱虫效果和性安全雨方面都令人完全满意的制剂不过是少数。Boray和Happich两氏(1968)用人工感染羊对这些肝片吸虫驱虫药     

青海血蜱幼蜱cDNA表达文库的构建及其保护性抗原基因的免疫学筛选

采用常规方法构建了青海血蜱幼蜱cDNA表达文库,初级文库的库容量为5.0×105PFU/mL,扩增后的库容量为8×109PFU/mL;用兔抗青海血蜱幼蜱阳性血清对该文库进行了免疫学筛选,对阳性噬菌体进行了亚克隆,提取质粒后转化宿主菌JM109,最终共得到幼蜱基因11个,分别命名为HqL1、HqL2、HqL3、HqL4、HqL5、HqL6、HqL7、HqL8、HqL9、HqL10、HqL11。测序分析表明,其中的6个为新基因。分析发现HqL7、HqL8、HqL9和HqL11具有较高的研究价值。     

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体,研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析,并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。     

片形吸虫线粒体nad1基因的序列分析及种系发育

为阐明来自中国、尼日尔、法国和美国的片形吸虫分离株在线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脱氢酶亚单位1基因(nad1)部分序列(pnad1)的遗传变异情况,并以pnad1序列进行种系发育研究,利用PCR扩增了中国、尼日尔、法国和美国片形吸虫分离株的pnad1序列并与GenBankTM中片形吸虫相应序列进行了比较,进行了种系发育分析.结果显示,所有片形吸虫样品的pnad1序列长度均为446 bp,中国、尼日尔、法国和美国肝片吸虫分离株与GenBankTM公布的肝片吸虫相应序列的种内变异为0.2%～0.7%,0.2%～0.9%,0.9%～2.0%,0.2%～0.9%;中国及尼日尔大片吸虫分离株与已报道的大片吸虫相应序列的种内变异为1.8%～2.7%,1.8%～3.4%;中国中间型虫株与中国及尼日尔大片吸虫分离株以及网上报道的大片吸虫的序列差异为5.6%～6.3%,5.6%～7.8%,5.7%～8.1%.中间型片形吸虫在遗传学上介于大片吸虫与肝片吸虫之间,但与大片吸虫的遗传关系更近.表明,片形吸虫pnad1序列可作为种间鉴定及种内遗传变异研究的标记;在中国的确存在中间型片形吸虫.     

PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果

采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

FGF2和FGFR在牦牛繁殖周期子宫的表达与定位

为探索成纤维细胞因子2(fibroblast growth factor,F2GF2)及成纤维细胞因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)在健康成年牦牛繁殖周期中的生物学功能,本研究选取了不同繁殖周期(发情期-卵泡期、发情期-黄体期、妊娠期-黄体期)牦牛子宫组织,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和免疫组织化学方法从基因和蛋白水平分别检测不同繁殖周期牦牛子宫FGF2和FGFR的表达和分布,用积分光密度方法分析FGF2和FGFR蛋白表达水平。结果显示,不同繁殖周期牦牛子宫中FGF2mRNA表达水平为:发情期-卵泡期发情期-黄体期妊娠期-黄体期(P0.01);FGFRmRNA表达水平为:发情期-黄体期妊娠期-黄体期发情期-卵泡期(P0.05)。FGF2和FGFR在牦牛不同繁殖周期的子宫内膜、子宫腺及血管上皮中均有表达,子宫内膜和子宫腺为主要表达部位,阳性细胞的细胞质中表达较高。积分光密度分析结果显示,FGF2蛋白表达水平为:发情期-卵泡期子宫发情期-黄体期子宫妊娠期-黄体期子宫;FGFR蛋白表达水平为:妊娠期-黄体期子宫发情期-卵泡期子宫发情期-黄体期子宫。以上结果表明,FGF2和FGFR在不同繁殖周期的表达差异性可能与其参与早期胚胎附植及胚胎发育的调控相关,这为进一步研究FGF2和FGFR在牦牛繁殖周期中的调控作用提供了理论依据。     

多房棘球蚴主要卵抗原p40-1的原核表达、多克隆抗体制备及其组织定位

初步确定MEAp40-1的基因特征及其组织分布特征。根据WormBase数据库中多房棘球蚴MEAp40-1序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增MEAp40-1编码基因并构建重组表达质粒pET-28a-MEAp40-1,IPTG诱导表达并用His-Ni亲和层析柱纯化,制备多克隆抗体。通过间接ELISA方法检测多克隆抗体效价,应用免疫荧光技术定位MEAp40-1在原头蚴中的分布。通过生物信息学分析发现,多房棘球绦虫表达3种不同的MEAp40(MEAp40-1～3),分别分布在不同染色体上。系统进化树显示,每个多房棘球绦虫MEAp40基因与其相应的细粒棘球绦虫的同源基因组成一支。多房棘球绦虫MEAp40-1编码基因全长945 bp,编码314个氨基酸。7种绦虫的MEAp40-1蛋白很保守,均存在α晶体结构域,并且位于该结构域中的协同分子伴侣结合位点也非常保守。MEAp40-1重组蛋白大小约为37 ku,其多克隆抗体效价可达1∶409 600,可识别虫体中的MEAp40-1天然蛋白。MEAp40-1蛋白主要分布在多房棘球蚴后端,而头节、囊壁等其他部位均未见表达。结合以上研究结果,推测MEAp40-1蛋白在绦虫中的生物学功能保守,可能与多房棘球绦虫原头蚴的发育有关。     

纤细背孔吸虫的卵黄细胞发育和虫卵超微结构观察

应用透射电镜和扫描电镜观察纤细背孔吸虫 (Notocotylusattenuatus)的卵黄细胞发育和虫卵超微结构。结果显示 ,纤细背孔吸虫卵黄细胞的发育过程分为 3个时期 :Ⅰ期为未发育的卵黄细胞期 ,细胞外形不规则 ,核大 ;Ⅱ期为发育中的卵黄细胞期 ,细胞增大 ,胞质内出现大量粗面内质网 ,卵黄颗粒明显增加 ;Ⅲ期为成熟卵黄细胞期 ,胞质内可见单个类脂滴并充满卵黄球 ,卵黄球内含卵黄颗粒 9～ 3 7个 (X =2 0 .45 ,n =2 0 )。虫卵两端具有卵丝 ,一端具有卵盖 ,卵盖与卵壳交接处有 2条环状隆起 ,卵内含有胚细胞和脂滴。胚细胞的胞质内含有核仁样的细胞质体和线粒体