胎衣不下奶牛围产期外周血浆孕酮和17β-雌二醇水平的变化特点

奶牛在产后12小时内不能排出胎衣者,一般认为是发生了胎衣不下(Retained Fetal Membranes,RFM)。与其他家畜相比,牛容易发生RFM。在无布病流行地区,正常分娩后RFM的发病率为3～12％,平均7％,在异常分娩后的母牛及患布病的牛群,RFM的发病率高达30～50％,甚至更高。由于RFM可引起子宫内膜炎而导致不孕,对奶牛业造成了很大的经济损失。关于生殖激素水平变化与RFM发生的关系,Agthe和Kolm(1975)报道,RFM牛产前孕酮(P_4)水平低,而雌激素水平在产前12小时明显升高。Chew等(1977)     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞后病毒复制及TLR3诱导表达的影响

本试验旨在探索猴头菇多糖(HEP)对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染RAW264.7细胞中病毒复制及TLR3诱导表达的影响,为进一步解析HEP在调节MDRV所致的番鸭机体免疫抑制中的作用机制提供数据参考。本试验首先通过测定HEP在小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)上的安全浓度的基础上确定HEP的添加浓度;然后通过RT-qPCR方法和Western-blot方法分别检测各组细胞中TLR3 m RNA的转录水平和TLR3、病毒σNS的蛋白表达量,从基因和蛋白的分子层面分析HEP对MDRV感染RAW264.7细胞的免疫调节作用。结果显示:HEP在46.88～187.5μg/m L浓度范围内是可以促进RAW264.7细胞生长,浓度为93.75μg/m L时细胞相对增殖率最高,VCG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)高于BCG组,HPG与HTG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)低于VCG组。结论:HEP可从基因与蛋白水平抑制MDRV感染早期过度活化的TLR3的表达,从而起到抗病毒作用。     

TGF-β1对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA表达的影响

为研究外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞表达CTGF mRNA的影响,用组织块法体外培养和纯化出奶牛乳腺上皮细胞,并应用免疫组织化学的方法鉴定细胞的纯度。然后用不同浓度的外源性TGF-β1(0,1,5,10ng/mL)作用乳腺上皮细胞,作用12,24,48,72h后分别提取细胞的总RNA,以β-actin作为内参基因,用实时荧光定量RT-PCR方法测定CTGF mRNA相对表达量的变化,并对CTGF的PCR产物进行测序分析。结果显示,TGF-β1处理组(1,5,10ng/mL)较对照组(0ng/mL)差异显著(P<0.05);处理组CTGF mRNA的相对表达量显著升高,并呈正量效关系:随着TGF-β1浓度的升高,CTGF mRNA的相对表达量基本呈逐渐升高的趋势。测序分析结果证明扩增产物为牛的CTGF基因序列,表明外源性TGF-β1可显著促进奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA的表达,进而在奶牛乳腺纤维化过程中发挥作用。     

绵羊SP-A基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

肺表面活性蛋白A(surfactant protein A,SP-A)具有维持肺内稳态、防御病原感染以及协助免疫应答等重要作用。本试验建立了定量检测绵羊SP-A基因及内参基因B2M(beta 2 microglobulin)m RNA表达水平的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,并采用该方法对健康滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊三个绵羊品种肺脏中SP-A m RNA的表达情况进行了检测。结果显示,SP-A基因和B2M基因的扩增效率分别为94.1%和95.9%;线性范围分别在1×10-1~1×10-6和1×10-1~1×10-7;相关系数分别为0.998和0.999;熔解曲线分别在84.5℃和83.0℃出现一个特异峰;滩羊SP-A m RNA的表达水平略高于小尾寒羊和滩寒杂交羊。本试验建立的绵羊SP-A基因实时荧光定量RT-PCR方法特异性好、检测线性范围广,为绵羊SP-A m RNA表达水平的检测提供了重要方法。     

高原甘加藏羊发情周期垂体FSH β和LH β mRNA表达差异的研究

为了研究高原甘加藏羊发情周期垂体组织中促卵泡素β亚基(FSHβ)和促黄体素β亚基(LHβ)基因在m RNA水平的表达规律,选取发情周期不同阶段的高原甘加藏羊24只,从其垂体组织中提取总RNA,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,以β-actin为内参基因,比较研究了高原甘加藏羊发情周期垂体组织中FSHβ和LHβ基因在m RNA水平的表达差异。结果显示,FSHβ和LHβ的m RNA在高原甘加藏羊发情周期不同阶段的垂体组织中均有表达。发情前期、发情期、发情后期和间情期的FSHβm RNA相对表达量分别为0.235 9、1.0、3.547 5和3.666 7,发情前期与发情期、发情后期和间情期差异极显著(P0.01),发情期与发情后期和间情期差异显著(P0.05),发情后期与间情期差异不显著(P0.05);LHβm RNA相对表达量为0.025 9、1.0、16.109 1和0.563 8,发情前期与发情期、发情后期和间情期差异极显著(P0.01),发情期与发情后期差异极显著(P0.01)、与间情期差异不显著(P0.05),发情后期与间情期差异极显著(P0.01)。因此,甘加藏羊发情周期内垂体组织中FSHβ和LHβ在m RNA水平上的表达呈现一种动态差异性变化趋势。本研究结果在分子水平上为揭示藏羊生殖内分泌调控机制提供了科学数据。     

奶牛胎衣不下的综合防治

笔者近年来,采取中西医结合治疗奶牛胎衣不下70余例,取得满意疗效。临床症状 奶牛胎衣不下分两种,一种是全部胎衣停留在子宫腔和产道内;另一种是部分胎膜残留在子宫内。无论全部或部分胎衣不下,患牛都表现有弓背、努责、阴门排出腐败恶臭的液体,甚至发烧不吃等全身症状。治疗方法 ①子宫放置土霉素40片或洗泌汰栓10枚或宫得康栓剂3枚,一次徒手放入胎膜与子宫之间。②后海穴注射缩宫素:用穿刺针从后海穴(牛尾巴根下凹陷处)与水平成15度向上刺入6～     

柔嫩艾美耳球虫穿孔素样蛋白基因的原核表达与亚细胞定位

为了研究柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)穿孔素样蛋白(Et PLP)在球虫感染中与宿主相互作用关系,首次成功获得EtPLP1(1 932 bp)和EtPLP2(4 215 bp)2个目的基因。通过表达纯化得到2个大小分别为37和67ku的目的蛋白,Western-blot结果显示其反应原性良好。通过免疫荧光技术,观察到EtPLP1定位在子孢子顶端。m RNA转录水平检测结果显示,EtPLP1在子孢子阶段的表达量最高,其次是第1代裂殖子阶段,EtPLP2m RNA水平在第1代裂殖子阶段表达量最高,其次是第2代裂殖子阶段;它们在其他阶段表达量极低或不表达。结果表明EtPLP1和EtPLP2可能参与虫体入侵与逸出宿主细胞,为EtPLPs蛋白功能研究奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒σA基因对鸡胚成纤维细胞天然免疫相关基因转录水平的调控影响

为了明确禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σA基因对宿主天然免疫应答的影响,本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞(DF1)后,不同时间点(转染后第3、6、12、24和36小时)DF1细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、MAVS、My D88、TRIF、IRF-3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果,与空载体转染细胞相比,pCAGEN-σA转染细胞中上述这些天然免疫基因的m RNA水平出现不同程度变化(P0.05或P0.01)。TLR3应对最快速,其m RNA水平在转染后第3小时和第6小时迅速上升,但9 h后逐渐下降;MDA5和TLR7的m RNA水平,则分别在转染后第6小时和第12小时开始显著升高,并分别在转染后第12小时和第36小时达到峰值(P0.05或P0.01);TLR15的m RNA水平整体变化不明显。My D88和MAVS的m RNA水平呈表达上调趋势;TRIF在转染后第6小时表达量迅速达到峰值(2.83倍),随后急速下降。NF-κB呈表达上调趋势;而IRF3/7的表达则被抑制。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)呈现相似的表达模式,在转染后第6小时和第24小时表达量增加,其他时间点均为表达量下降; IL-6和IL-8则表达上调,分别在转染后第9小时和第6小时达到峰值(P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的m RNA水平也显著升高,均在转染后第12小时达到峰值(P0.01)。上述试验结果表明,在DF-1细胞中过表达σA基因,能显著引起天然免疫相关基因的表达的变化,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机理奠定了基础。     

牛疱疹病毒Ⅰ型感染对牛胚气管细胞Toll样受体2表达的影响

为研究牛疱疹病毒Ⅰ型(BH V-1)对体外非免疫细胞——牛胚气管细胞(EBTr)表达Toll样受体2(TL R 2)的影响,了解TLR2在BHV-1感染时介导的天然免疫反应机制,本试验将EBTr细胞分为BHV-1感染组和对照组,分别收集培养后第6、12、18、24及48小时的细胞总RN A和总蛋白,通过荧光定量PCR和W estern-blot技术,检测感染BHV-1后TLR2在基因和蛋白水平的动态变化。结果显示,在第6和12小时,感染组TLR2 m RNA和蛋白的相对表达量均低于对照组;在第48小时,感染组TLR2 m RNA和蛋白的相对表达量均显著高于对照组(P0.01)。结果表明,BHV-1感染EBTr细胞会影响TLR2 m RNA和蛋白的表达,提示TLR2参与宿主细胞对BHV-1的识别,触发天然免疫,这为探索BHV-1感染的免疫机制提供了依据。     

预防奶牛胎衣不下的新方法

我场自1984年以来,对娩后奶牛一律在产后半小时内肌肉注射脑垂体后叶素50单位(每支1毫升含10单位)。在产后半小时到5小时内一般都能使胎衣全部排出,最迟一例在产后8小时排出。共试治53头,无一例胎衣不下,并对5头奶牛作了对照试验,产后除喂益母草浸泡液外,不予药物注射,结果2头奶牛胎衣不下,后来虽然治愈,但配种却很困难。可见,产后注射垂体后叶素,不但能止血,而且还能促进胎     

预防奶牛胎衣不下

我场奶牛产后胎衣不下发生率1981年为51头,占全年分娩奶牛数的21.3％;1982年为28头,占全年分娩奶牛数的11.3％。它不但加大了兽医人员工作量和药费开支,更重要的是子宫内胎衣腐败分解引起感染而多数并发脓性卡他性子宫内膜炎,轻则使奶产量大大下降,重则造成不孕,丧失经济价值被迫淘汰。 由于我场奶牛副结核性肠炎存在时间长、发病率高,使奶牛对饲料中蛋白质、矿物质、维生素的消化、吸收受到较大影响,特别是奶牛分娩后大量钙盐和维生素等营养物质进入初乳,引起血钙和血糖浓度骤然下降,导致瘫痪和子宫弛缓而并发胎衣不下。基于这种认识,我们从1983年4月起对奶牛分娩后,立即通过静脉注射补充钙盐、葡萄糖等和其他措施预防胎衣不下,收到满意的效果。 具体作法 奶牛产后(不分昼夜)立即喂饮红糖麸皮水(红糖6斤、麸皮2斤,温水50斤),随即静脉注射25％葡萄糖1000毫升、10％盐水500毫升、10％安钠咖20毫升、5％氯化钙500毫升。注射后胎衣多     

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响

为了探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比(MOI)为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

翁苋颗粒对患鸡白痢雏鸡chTLR4和IL-1β及TNF-α mRNA表达的影响

为探讨翁苋颗粒对雏鸡感染鸡白痢后chTLR4、IL-1β、TN F-αm RNA表达的影响。采用腹腔注射鸡白痢沙门菌菌液的方法人工复制鸡白痢的病理模型,通过在饲料中添加一定比例的翁苋颗粒,于试验后各组随机取雏鸡剖解采样,检测法氏囊组织中chTLR4、IL-1β、TNF-αm RNA表达量。结果显示,与空白组比较,感染对照组雏鸡法氏囊chTLR4、IL-1β、TNF-αm RNA表达水平升高,差异极显著(P0.01);与感染对照组比较,翁苋颗粒组、药物对照组雏鸡法氏囊chTLR4、IL-1β、TNF-αm RNA表达水平降低,差异极显著(P0.01)。结果表明,翁苋颗粒可通过下调chTLR4、IL-1β、TNF-αm RNA的表达水平,从而起到防治雏鸡白痢的作用。     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR检测

为了检测培养的蒙古绵羊输卵管上皮细胞内sBD-1 mRNA表达水平,运用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术进行了相对定量测定.首先,建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,提取细胞总RNA,根据GenBank中羊β-防御素基因序列,设计合成引物,进行实时荧光定量PCR.以β-Actin基因为内参基因,对sBD-1 mRNA进行均一化处理,利用荧光阈值(C2值)计算sBD+1 mRNA的相对表达量.经测序分析,扩增产物为β-防御素.结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素mRNA表达水平的相对含量.     

奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体的构建与表达

为探讨应用转基因动物技术降低奶牛乳腺炎发病的可行性,参照人溶菌酶(human lysozyme,hLZ)基因序列(NM_000239.2)设计引物,采用RT-PCR方法从人胎盘组织中成功扩增克隆了406bp的hLZ基因成熟肽片段。应用娟姗牛酪蛋白乳腺特异表达调控元件,经过多步酶切、连接、转化、筛选、鉴定,构建成奶牛乳腺表达hLZ的载体pBCN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(13.6kb)和pBCN-3.8-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(12.2kb)。将构建的2个载体瞬时转染Bcap细胞,24h后可观察到EGFP的表达;通过实时定量PCR检测比较2个载体hLZ的表达丰度,结果,相对表达量分别为0.89±0.04和0.62±0.05。将线性化的pB-CN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo载体转染Bcap细胞,筛选后获得阳性细胞克隆,纯化阳性细胞总蛋白进行SDS-PAGE分析,与空白对照相比,检测到14ku的新蛋白条带。Western-blot分析中亦出现14ku的特异性条带。证实构建的载体能够正常表达hLZ基因,这为进一步研究获得自然抵抗乳腺炎的转基因奶牛奠定了工作基础。     

穴位注射麦角新硷治疗牛胎衣不下

试用麦角新硷注射液,行后海穴注射治疗胎衣不下58例(其中牛42例,羊16例),用药后1～6小时胎衣即可自行排出。 治疗方法 将患畜站立保定在六柱栏内,于后海穴(肛门与尾根之间凹陷正中处)向前上方与尾荐椎平行刺入4～6厘米,注药2～3毫克,用药1～2次可排出胎衣。 病例 商丘地区良种场,1头4岁奶牛,1980年6月21日来院就诊,该牛产后胎衣不下,不吃不反刍,精神沉郁,弓背频频努责,口腔滑利,结膜淡白,后阴部污染,有少部分胎衣脱出阴外,排出腥臭粘液,站立不安,回头顾腹,后躯不时摇摆。 治疗 麦角新硷注射液2毫克,后海穴一次注入,0.1％高锰酸钾水冲洗子宫, 1小时胎衣自行排出。     

皮蝇Hypodermin C基因的克隆及重组表达载体的构建

参照牛皮蝇HypoderminC(HC)基因的核苷酸序列 ,设计了 1对引物 ,以牛皮蝇总RNA为模板 ,用RT PCR扩增了牛皮蝇HC基因 ,将扩增基因进行克隆测序。测序结果表明 ,所获得基因与已知序列同源性达 99.4 5 %。同时 ,将该基因与表达载体 pGEX 4T 1连接 ,构建并获得阳性重组表达载体。     

猪囊虫抗原基因TS21的真核表达

构建了猪囊虫抗原基因TS2 1的VR10 2 0真核表达载体 ,以菌落原位杂交法筛选获得正确插入的重组质粒 ,用RNA印迹 (Northernblotting)和ELISA检测插入片段的转录及其翻译表达产物。结果 ,VTS2 1在真核细胞中能够转录TS2 1基因的mRNA ;兔抗猪囊虫超免疫血清可识别其蛋白表达产物 ,表明VTS2 1能正确表达猪囊虫抗原蛋白     

堆型艾美耳球虫早熟系与母株11种抗原基因表达水平的比较分析

应用荧光定量qRT-PCR技术比较堆型艾美耳球虫早熟系及其母株孢子化卵囊的11种抗原基因的表达情况。提取堆型艾美耳球虫早熟系及其母株孢子化卵囊的总RNA,反转录成cDNA,在GenBank中查找堆型艾美耳球虫11种抗原基因并设计相应引物,进行荧光定量qRT-PCR扩增,用熔解曲线、扩增曲线和循环阈值(Ct值)的变化等比较分析堆型艾美耳球虫早熟系及其母株的不同基因的扩增特异性和相对表达量。结果显示,11种抗原基因得到表达;与疫苗母株相比,早熟致弱的疫苗株大部分抗原基因的表达量下降,其中HSP70基因表达量下降明显。结果表明,早熟系毒力的减弱可能与某些抗原基因表达量下降有关。