三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

犬细小病毒SH14株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

为分离犬细小病毒(canine parvovirus,CPV),用疑似犬CPV感染的病犬肠组织研磨液接种猫肾细胞(CRFK),进行病毒分离,并利用常规病毒学和分子生物学方法以及动物回归试验鉴定分离的病毒,并对其VP2基因序列进行测定及分析。结果显示,该病毒能在CRFK细胞上良好生长并产生细胞变圆、脱落等特征性细胞病变;细胞培养物能扩增出CPV的特异性基因组;对病毒的VP2基因序列和推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,本研究的分离毒株属于New CPV-2a型,与CPV SH-2/2011株的亲缘关系最近,其核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为99.83%和100%。上述结果表明,成功分离到1株New CPV-2a型犬细小病毒,将其暂命名为SH14株。本研究结果为进一步研究我国犬细小病毒的进化和变异,以及疫苗的研制奠定了物质基础。     

犬细小病毒JL-(18)1/Beagle株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒(CPV)流行株遗传变异情况,本研究从吉林省某比格犬养殖场采集疑似CPV感染致死犬的肠道组织,将病料接种至F81细胞进行病毒分离,并通过电镜形态学、PCR、血凝试验及动物回归试验进行鉴定。结果显示,所分离的这株病毒在F81细胞中产生了典型CPV细胞病变(CPE);在电镜下可见病毒呈无囊膜、直径为20 nm左右的病毒粒子;PCR鉴定证实CPV核酸呈阳性;血凝试验表明此病毒对猪红细胞具有凝集作用,血凝效价为1∶256;将这株病毒命名为JL-(18)1/Beagle。动物回归试验表明,JL-(18)1/Beagle使比格犬产生犬细小病毒感染的典型临床症状;以NS1基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与CPV-2c型分离株CPV-SH1516以及Canine/China/23/2017 NS1基因亲缘关系较近,而核苷酸相似率为100%;以VP2基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与New CPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近,核苷酸相似率为99.89%~99.94%;以VP2蛋白氨基酸进行序列分析表明,JL-(18)1/Beagle属于New CPV-2b型,与近期吉林CPV分离株相比,关键氨基酸位点无明显变化。因此,本试验从吉林省比格犬肠组织中分离到1株New CPV-2b型CPV毒株。     

犬细小病毒兰州分离株VP2基因的克隆及进化树分析

本研究首次对地处西北地区的兰州的犬细小病毒分离株(命名为CPV/LZ-kbz11)进行了VP2基因克隆、测序,并与参考株、我国各地区流行株以及周边国家流行株进行了进化树分析和核苷酸同源性比较。结果显示,该毒株能在犬肾细胞系(MDCK)上成功生长,但不引起细胞病变。该分离株为CPV-2b亚型毒株,与M19296(CPV-2亚型参考毒株)、EU659118(CPV-2a亚型参考毒株)、EU145954(CPV-2b亚型参考毒株)、AB054224(CPV-2c亚型参考毒株)的核苷酸序列同源性分别为99.0%、99.3%、99.2%、99.2%;与我国及周边主要流行毒株EU213079(CPV-2a,浙江)、EF666059(CPV-2a,北京)、EF599096(CPV-2a,韩国)、EF592511(CPV-2a,台湾)、EU483512(CPV-2b,浙江)、FJ222821(CPV-2c,意大利)的核苷酸同源性分别为99.6%、99.5%、99.4%、99.4%、99.4%、99.4%。对VP2基因中非同义置换的氨基酸分析结果显示,兰州分离株与对比毒株的非同义突变位点共有4处,分别在第267位、324位、426位和440位的氨基酸处。     

犬细小病毒SH15株的分离鉴定与全基因组分析

为了解上海地区犬细小病毒的流行及其变异情况,从疑似犬细小病毒感染的死亡犬采集各种组织,无菌处理病料后同步接种F81细胞,盲传至第5代出现细胞病变,从肠组织中分离出1株病毒。采用电镜进行病毒形态学观察,以及HA、HI和PCR等方法鉴定病毒,结果证实为犬细小病毒,命名为CPV-SH15。该病毒的血凝效价为2~9,病毒TCID_(50)为10~(5.2)/m L,测得病毒编码区基因序列的全长为4 869 bp,与上海分离毒株CPV/CN/SH1/2013的同源性为99.8%,亲缘关系较近,说明上海地区的犬细小病毒的遗传变异并不明显。对其VP2基因的氨基酸序列进行分析,确定该细小病毒属于New CPV-2a亚型。该研究为犬细小病毒遗传进化的进一步研究奠定了基础,从而为犬细小病毒病疫苗的研制以及防控提供参考。     

犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达

从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV-JS12株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pH10可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV-JS12为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.3%~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV-JS12株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV-JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

藏獒源犬细小病毒的分离鉴定

为弄清犬细小病毒(CPV)在藏獒中的流行情况,将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠棉拭子8份处理后接种猫肾传代细胞(F81细胞),分离到6株病毒,对其进行了血凝试验(HA)、半数组织培养物感染剂量(TCID50)的测定,理化性质鉴定,提取分离株DNA并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其一特异性片段和VP2全序列,并与GenBank上登录的CPV毒株进行比对。结果表明,接毒后第6～13天在F81细胞上出现了明显的细胞病变(CPE),表现为细胞融合、变圆或拉长;所得分离株能使猪红细胞发生凝集反应,血凝效价为27～211;能抗酸(pH3)、热(60℃)、200mL/L乙醚、480mL/L氯仿;从细胞培养物中分别扩增出与特异性片段825bp一致以及与VP2全基因1 755bp一致的条带。将扩增的VP2序列与GenBank上登录的HQ883267.1、FJ222823.1、FJ005214.1等10个国内外CPV分离株的VP2序列进行比对;结果显示,与北京地区一分离株(HQ883267.1)的同源性最高,为99.0%～99.6%。所得分离株为不同毒株,但均为CPV-2a型。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

猫细小病毒广西分离株FPV-GX01全基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西地区猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的生物学特性,阐明其基因组与遗传进化等特征。笔者采集经胶体金检测FPV阳性的粪便样品接种FK81细胞,进行病毒分离及理化特性鉴定,同时利用PCR分段扩增病毒基因组DNA,并与国内外分离株进行同源性及遗传进化比较分析。结果显示,分离株在FK81细胞上盲传3代后出现CPE,猪红细胞血凝价达1∶1 024,第5代病毒TCID50测定为10-5.2/0.1 m L,该毒株对热、酸、氯仿及乙醚有较强的抵抗力,将分离株命名为FPV-GX01。全基因测序结果表明,分离株基因组为4 901 bp,与2007年我国猫源细小病毒株FPV-XJ1同源性高达99.0%,属同一分支。氨基酸位点分析显示,FPV-GX01株VP2蛋白功能较少发生突变,与犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)氨基酸位点存在宿主差异;FPV-GX01 NS1蛋白序列上没有VP2蛋白稳定,第619位异亮氨酸突变成苯丙氨酸。广西地区分离的猫细小病毒也在不断发生遗传变异进化,本研究对该地区猫细小病毒的进化特征提供了一定的参考。     

樱桃谷肉鸭源细小病毒QH-L01株的分离鉴定及VP1基因序列分析

2016年4月,四川邛崃某鸭场送检30只樱桃谷肉鸭,临床表现鸭喙变短、舌头伸出。从送检鸭脏器中分离鉴定出1株鸭源细小病毒,命名为QH-L01株。为进一步了解该病毒毒力及分子生物学特性,对其进行ELD50测定、VP1基因测序,并与其他细小病毒毒株进行比较。ELD50测定结果为10-6.54ELD50/0.2 m L;VP1核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,该病毒结构基因全长2 203 bp,编码734个氨基酸,与鹅细小病毒核苷酸同源性为92.8%~99.8%,与番鸭细小病毒同源性为77.4%~87.3%;VP1编码的氨基酸同源性和鹅细小病毒及番鸭细小病毒分别为95.2%~99.5%和85.4%~91.1%。VP1基因进化分析显示,该病毒和鹅细小病毒SYG26-35分离株处于同一进化分支上。动物回归试验结果显示,试验组出现明显的鸭源细小病毒BADS症状,对照组无明显变化,表明该病毒分离鉴定成功。     

犬细小病毒2b亚型VP2基因的克隆及其B细胞抗原表位分析

对犬细小病毒2b亚型衣壳蛋白VP2基因进行了克隆、测序,并用分子生物学软件DNAStar对VP2基因的推导氨基酸序列进行了表位分析。结果显示,获得了犬细小病毒2b亚型的VP2基因,序列全长1 755 bp,编码584个氨基酸;B细胞表位主要位于VP2蛋白第1~38、73~83、86~104、152~195、235~243、294~326、347~400、404~416、469~483、503~521和571~585区段。表明,犬细小病毒2b亚型VP2蛋白上分布有多个B细胞抗原表位,这为犬细小病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物,应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段.将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR 3.1 T载体上,MDPV YZ株基因大小为1764 bp,编码528个氨基酸,并对插入片段进行序列测定.测定结果表明,我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%.     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的序列分析

将番鸭细小病毒强毒株MDPV-Q经番鸭胚传代,获得致弱株MDPV-26,应用PCR技术扩增MDPV-26株的VP2基因片段,将扩增后的VP2基因重组到pMD 18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定,将测序结果及由该结果推导的氨基酸序列分别与MDPV-Q株及国外已发表的MDPV相应序列进行同源性比较及分析.结果表明,MDPV 26与强毒株MDPV-Q的VP2基因序列及与国外分离株均具有很高的同源性.     

猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及其结构蛋白VP2可溶性表达的调控

为了研究猫泛白细胞减少症病毒（FPV）的生物学特性,可溶性表达FPV结构蛋白,研发基于VP2的新型亚单位疫苗,采集40份疑似FPV阳性的中华田园猫粪便样本,通过qPCR对样本检测后利用细胞培养、血凝试验、PCR和电镜观察等试验鉴定分离株,并对其VP2基因进行同源性比对。同时,构建pET-28aVP2、pET-28a-SUMO-VP2和pET-22a-SUMO-VP2重组质粒并利用大肠杆菌进行表达。结果显示,成功分离出1株FPV毒株;生物信息学分析表明,该毒株的VP2基因与此前报道的毒株同源性高达99%。蛋白表达结果显示,单独使用SUMO标签对VP2蛋白的可溶性表达影响较低;然而,当带有SUMO标签的重组质粒与4个分子伴侣（p G-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16）分别共表达时,可溶性VP2的表达量可显著提高。该研究可为FPV亚单位疫苗研发提供数据和有效的生物材料。     

乌骨鸡J亚型禽白血病病毒的分离及其全基因组遗传进化分析

为了解云南地方品种盐津乌骨鸡感染禽白血病病毒（ALV）的情况,从云南省盐津县某规模化盐津乌骨鸡种鸡场中分离ALV,并对1株ALV-J(YN2021株)的全基因组进行序列分析。结果显示,该场乌骨鸡的ALV感染阳性率为16.66%,以ALV-J亚型感染为主,也存在ALV-B亚型单独感染和ALV-J/B亚型混合感染。测序表明YN2021株基因组全长7 618 bp,与参考毒株核苷酸同源性为65.0%～97.1%,其中env基因N端糖基化位点与参考毒株存在差异;遗传进化分析显示,YN2021株可能是由ALV广东株和广西株重组产生的。本研究首次报道了云南地方品种盐津乌骨鸡中ALV-J的全基因序列,为我国研究ALV-J遗传进化奠定了基础。     

无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达

分离出1株在4、25、37℃条件下均不能凝集人"O"型红细胞的兔出血症病毒(RHDV),命名为SQ-1株;采用RT-PCR扩增获得病毒主要结构蛋白VP60蛋白基因,并对目的基因进行测序及分析;将目的基因定向克隆入原核表达载体pET-30a的多克隆位点,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,纯化重组蛋白,用Western-blot检测其反应原性。测序与同源性分析结果显示,该毒株属于RHDV抗原遗传变异株(RHDVa),所扩增的VP60基因的ORF为1 740bp,编码579个氨基酸残基,与世界上其他RHDV毒株的核苷酸序列的同源性为89.9%～98.0%,与已报道的无血凝特性的病毒株whn-1株及低血凝性的Rainham株的核苷酸序列的同源性分别为95.2%及90.8%。重组质粒经IPTG诱导后目的基因获得表达,重组蛋白与预期大小一致,分子质量约为60ku,主要以包涵体形式存在。Western-blot检测证实,纯化蛋白能够与RHDV阳性血清发生良好的杂交反应,说明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列、犬细小病毒(CPV)VP2基因序列和犬冠状病毒(CCV)M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV(193 bp)、CDV(500 bp)和CCV(780bp)的多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。     

貉源犬腺病毒Ⅰ型的分离鉴定及生物学特性分析

用MDCK细胞从患病貉的临床样品中分离出1株病毒,并采用PCR、测序分析、免疫荧光试验、血凝试验和理化特性试验进行鉴定。结果显示:PCR扩增得到500 bp条带,其核苷酸序列与犬腺病毒Ⅰ型(CAV-1)同源性为93.2%～98.7%,而与CAV-2同源性仅为55.3%;接种该病毒的MDCK细胞出现了"葡萄串样"细胞病变(CPE),且胞核中有特异性亮绿色荧光;病毒滴度为1×107.4TCID50/m L;该病毒可以凝集人O型红细胞和豚鼠红细胞;对FUDR敏感,对乙醚、热、酸有一定的抵抗力。以上结果表明,本研究分离的病毒为貉源CAV-1。为了解CAV-1对貉的致病性和疫苗开发提供了依据。     

番鸭细小病毒弱毒株VP2基因的分子克隆与序列测定

将番鸭细小病毒(MDPV)强毒Q株经番鸭胚连续传代,获得致弱株MDPV-26.根据已发表的MDPV的全基因序列,设计了1对引物LHMP7/LHMP8,同时在这2条引物中分别加入2种限制性核酸内切酶SacⅡ和KpnⅠ的酶切位点.应用PCR技术扩增了MDPV-26株的VP2基因片段.将扩增后的基因片段重组到pMD18-T质粒载体上,并对插入片段进行序列测定.测序结果表明,弱毒株MDPV-26与强毒株MDPV-Q的VP2基因序列相同率达99.7%,与国外分离株的同源性为98.3%,说明强、弱毒株的VP2基因序列变化不大.     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。