桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜及icaA表达的抑制作用

为研究桃柁酚对金黄色葡萄球菌生物膜及icaA表达的抑制作用,用微量肉汤稀释法测定桃柁酚对10株金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度,并利用激光共聚焦显微镜观察桃柁酚抑制生物膜的情况;通过实时荧光定量RT-PCR技术检测桃柁酚对细菌生物膜形成过程中相关基因的水平变化;采用斑点免疫印迹法检测细胞间多糖黏附素在生物膜形成过程中的作用。结果显示,桃柁酚对金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜的最小抑菌浓度值范围分别为1～2μg/mL和4～16μg/mL;能杀灭和清除已形成的生物膜;桃柁酚可通过影响agr和sar调控系统,抑制细胞间多糖黏附素合成基因icaA的表达进而抑制细胞间多糖黏附素的合成。表明桃柁酚能有效抑制金黄色葡萄球菌浮游菌和生物膜,是一种抑制金黄色葡萄球菌生物膜的有效药物。     

牛乳源金黄色葡萄球菌生物被膜形成与耐药性的研究

为探讨金黄色葡萄球菌生物被膜形成与耐药性之间的关系,本研究对分离于宁夏地区牛乳腺炎的50株金黄色葡萄球菌进行药敏试验,采用刚果红琼脂法检测金黄色葡萄球菌的生物被膜形成能力,同时用PCR方法对菌株的生物被膜相关基因进行检测。结果显示,金黄色葡萄球菌耐药情况严重,普遍存在多重耐药现象;受试菌株有36株菌(72%)为生物被膜阳性菌株,有14株菌(28%)为生物被膜阴性菌株;受试菌株生物被膜相关基因的检出率分别为icaA(96%)、sarA(76%)、fnbA(100%)、fnbB(100%);生物被膜阳性菌株对大多数抗菌药物的耐药率高于生物被膜阴性菌株,但二者只对克林霉素的耐药率具有统计学意义(P0.05)。本研究结果表明,金黄色葡萄球菌生物被膜的形成机制复杂,生物被膜的形成在金黄色葡萄球菌的耐药性方面起到了一定的促进作用。     

苦地胆内酯类化合物的制备及其体外抑菌效果研究

为探讨中药苦地胆有效成分苦地胆内酯的抗菌效果,用浓度为800mL/L的乙醇溶液进行热回流浸提,制备苦地胆内酯的粗提物,经硅胶柱层析分离、纯化,再结晶,制得苦地胆内酯类化合物,用薄层层析法进行苦地胆内酯检测与鉴定,并进行了苦地胆内酯类化合物的体外抑菌试验。结果显示,当浓度为2.0mg/mL时,苦地胆内酯类化合物对巴氏杆菌、蜡状芽孢杆菌具有明显的抑制作用(P0.05),对金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和鸡大肠杆菌呈现极明显的抑制作用(P0.01);浓度分别为50、10mg/mL时,苦地胆内酯类化合物对5种供试菌均有极明显的抑制作用(P0.01)。苦地胆内酯类化合物对供试金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌、巴氏杆菌、鸡大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为0.313、0.313、0.156、0.625mg/mL和1.25mg/mL;对蜡状芽孢杆菌的最小杀菌浓度为2.5mg/mL,对其他4种供试菌的最小杀菌浓度均为0.625mg/mL。表明,苦地胆内酯类化合物具有很好的体外抗菌效果。     

阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的药代动力学和药效动力学关系

建立了体外药代动力学和药效动力学(PK-PD)模型,测定了阿莫西林杀灭金黄色葡萄球菌的药代动力学参数和药效动力学参数,并研究了它们之间的关系.结果表明,T＞最低抑菌浓度(MIC)是衡量阿莫西林药效的关键指标,当阿莫西林浓度超过MIC时,初始浓度0.4～3.2μg/mL对杀灭金黄色葡萄球菌的药效没有影响.在消除半衰期为2 h的模型内,T＞MIC在7.40 h以上时阿莫西林对金黄色葡萄球菌有较好的杀灭效果;在消除半衰期为5.5 h的模型内,T＞MIC在11.76 h以上时阿莫西林对金黄色葡萄球菌有较好的杀灭效果.     

大环内酯类药物对木糖葡萄球菌生物被膜形成的影响

为探索大环内酯类抗生素是否具有干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的能力,采用微量稀释法确定大环内酯类药物红霉素、阿奇霉素以及泰乐菌素对木糖葡萄球菌的最小抑菌浓度,结果分别为0.8、1.6和0.8μg/mL。另外,通过结晶紫染色法、XTT法和LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit染色方法考察了这3种药物对生物被膜的干预作用。结果显示,0.4μg/mL红霉素、0.8μg/mL阿奇霉素和0.4μg/mL泰乐菌素均对木糖葡萄球菌生物被膜的形成能力有干预作用,并且在不同的木糖葡萄球菌菌株呈现出相同的趋势。上述结果表明,大环内酯类药物(红霉素、阿奇霉素和泰乐菌素)能有效地干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成。     

司帕沙星体外抗菌活性的试验

应用试管二倍稀释法测定司帕沙星对大肠埃希氏菌、沙门菌、链球菌、金黄色葡萄球菌和禽败血霉形体等病原微生物的最小抑菌浓度 (MIC)和最小杀菌浓度 (MBC) ,并与 4种氟喹诺酮药物及 3种其他抗菌药物相比较。结果表明 ,司帕沙星对大肠埃希氏菌、沙门菌、链球菌、金黄色葡萄球菌和禽败血霉形体均有良好的体外抗菌活性 ,优于其他对照药物     

红茂草生物碱抑菌活性的测定

用醇提法提取红茂草生物碱,经石英色谱柱层析分离、结晶后测定了红茂草生物碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、粪肠球菌的体外最小抑菌浓度(MIC)、抑菌率和半数抑菌浓度(IC50)。结果显示,红茂草生物碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、粪肠球菌的MIC分别是0.22、0.18、0.18、0.30mg/mL;对这4种供试菌的IC50分别是0.180 7、0.140 70、.140 70、.260 5 mg/mL。表明,红茂草生物碱对这4种细菌具有明显的抑制作用。     

硒化甘草多糖联合抗生素体外抑菌作用及体内免疫调节作用研究

旨在研究硒化新疆乌拉尔甘草多糖(Se GUP)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌是否有较好的体外抑菌作用,与抗菌药物联合使用是否能够增强抗菌药物的抑菌效果及其免疫相关活性研究。采用微量法检测Se GUP与抗生素的最小抑菌浓度(MIC),筛选出3种较为敏感的常用抗生素;采用棋盘法测算出Se GUP与所筛选的对细菌敏感的抗生素进行联合后的FIC指数,判定Se GUP与抗生素联合作用性质;采用ELISA法,测定不同剂量Se GUP组小鼠血清中Ig G、IL-1、IL-2含量,确定其免疫活性调节作用。体外抑菌试验结果表明,Se GUP对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌均有一定的抑制作用,其MIC值分别为100、200 mg/mL;头孢噻呋钠、卡那霉素与Se GUP联合作用后,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌耐药菌株均表现为一定的相加作用,其MIC值分别降低到25、50、50、50 mg/mL,而与恩诺沙星进行联合后的抑菌效果并不明显,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌耐药菌株表现为无关作用。免疫试验结果表明,不同剂量的Se GUP对小鼠血清中Ig G、IL-1和IL-2的含量均有不同程度的提高作用,其中,高、中剂量组的Se GUP的提高作用显著(P0.05),与免疫抑制组相比差异极显著(P0.01)。由此可知,一定剂量的Se GUP与头孢噻呋钠、卡那霉素联合后,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果的同时,能减少抗生素的使用剂量,并且Se GUP能提高小鼠血清中相关细胞因子含量,增强机体免疫力。本次试验结果为充分挖掘中药中有效成分提供了更多理论依据,为寻找更多有效防治金黄色葡萄球菌、大肠杆菌病的药物组合和对抗及减缓多重耐药菌株出现提供了新思路。     

金黄色葡萄球菌凝聚因子A区基因的克隆表达及表达产物的免疫学特性

采用PCR技术对引起乳牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌凝聚因子(ClfA)A区基因进行了扩增和克隆测序,并对测序结果用DNAStar软件进行了抗原表位分析,成功构建了原核表达质粒pET-32a-ClfA A.将其转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,证实目的蛋白以可溶形式存在.用His·Bind柱对其纯化后获得了纯度较高的蛋白.纯化后的蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫家兔得到了较高效价的抗血清,通过ELISA、试管凝集试验、吞噬调理试验、抗体抗金黄色葡萄球菌黏附能力检测等对表达产物及制备的超免疫血清进行了检测.试验证明目的蛋白具有黏附活性,自制的超免疫血清具有抗金黄色葡萄球菌黏附至牛纤维蛋白原的作用以及吞噬调理作用,所表达的蛋白为ClfA A蛋白.     

金黄色葡萄球菌336型多糖偶联抗原的制备及免疫原性

采用溶葡萄球菌酶消化菌体释放金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)336型多糖(Type 336polysaccharides,336PS),梯度乙醇浓度浸提和用不同酶消化进行粗提,通过凝胶过滤层析纯化得到了336PS多糖,并对其纯度进行检测。将336PS通过ADH间桥法与BSA连接制备偶联抗原,采用凝胶过滤层析纯化,200~400nm波长扫描鉴定,从层析波峰和检定波长判定偶联成功。加佐剂制备成疫苗免疫小鼠,进行抗体检测和小鼠免疫保护试验。结果表明,纯化的336PS纯度为685.1g/kg;偶联抗原波峰较BSA前移,其原最高吸收波峰为212nm,从206nm向280nm偏移。偶联抗原336PS-BSA可以刺激小鼠产生抗336PS的免疫应答反应,并能够对免疫小鼠提供免疫保护作用。     

蓝狐源嗜酸乳杆菌ZJBF003株的分离鉴定及其体外益生潜能的评价

为获得动物源乳酸菌并对其益生潜能进行评价,对蓝狐源乳酸菌进行了分离鉴定并通过测定其生长曲线、产酸能力、对低p H和高胆盐环境的耐受性、在体外模拟胃肠道溶液中的存活能力、抑菌能力、抗生素抗性、对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力、抗氧化性及安全性评价了菌株的益生特性。将从蓝狐的肠道内容物中分离到的1株优势乳酸菌命名为ZJBF003,经菌落菌体形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析将其鉴定为嗜酸乳杆菌。该菌株的产酸能力较强且在37℃培养时能迅速进入对数生长期;在pH为5的MRS培养基中耐受6 h时仍能保持较好的生长情况,在胆盐质量浓度为3 g/L的条件下至少可耐受6 h,且存活率接近70%,在人工模拟胃液和肠液中耐受3 h时存活率高于95%;对大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果;对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力为(39.03±6.57)CFU/cell;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为24.80%,表明菌株ZJBF003具有一定的抗氧化活性;小鼠安全性试验结果表明,无毒副作用。这些特性表明,新分离的蓝狐源嗜酸乳杆菌ZJBF003株具有优良的体外益生性能,可作为潜在益生菌制剂材料进一步研究。     

金黄色葡萄球菌噬菌体SP-2裂菌特性分析

为筛选高效裂解金黄色葡萄球菌的专性噬菌体,有效防控养殖场耐药病原菌感染,本研究采集奶牛场粪水样本,利用实验室培养的金黄色葡萄球菌分离裂解性噬菌体,鉴定分析噬菌体的理化特征和生物学特性,测定裂菌效率及裂菌谱;通过模拟污染地面,研究该噬菌体的环境杀菌潜力。结果显示,分离到1株双链DNA噬菌体SP-2,属于短尾噬菌体科(Podoviridae),裂菌谱广,不仅能裂解实验室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),而且对食源性及医院临床分离的金黄色葡萄球菌也有很好的裂解作用;在体外杀菌试验中,噬菌体SP-2可在3 h内裂解MRSA菌株PNB25;环境消毒模拟试验结果显示,经噬菌体SP-2喷雾处理后,对平板内细菌的杀菌效率高达90.8%。结论,噬菌体SP-2对金黄色葡萄球菌具有高效、种内广谱的裂解作用,有望成为防控金黄色葡萄球菌感染的一种抗菌制剂及环境消毒剂。     

东北细毛绵羊金黄色葡萄球菌性乳腺炎的微动脉解剖学研究

为了研究金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎中乳腺微动脉的变化,在东北细毛绵羊左侧的乳腺注射1 m L金黄色葡萄球菌(109 CFU/m L),而在右侧乳腺注射1 m L生理盐水作为对照。48 h后,屠宰东北细毛绵羊并取其乳腺做成血管铸型标本,对乳腺微动脉进行管径测量和扫描电镜观察。结果显示,东北细毛绵羊左侧乳腺的微动脉内膜表面呈粗糙状和有球状细胞黏附现象,对球状细胞直径进行测量后,推测该细胞为中性粒细胞。结果表明,金黄色葡萄球菌诱导的乳腺炎能够改变乳腺微动脉的结构。     

Metalnikowin类抗菌肽MLP的设计及其抗菌活性的测定

为设计新型Metalnikowin类抗菌肽并评价其抗菌活性,依据抗菌肽Metalnikowin的作用机理和氨基酸组成,通过人工方法设计合成Metalnikowin类抗菌肽(Metalnikowin-like antibacterial peptide,MLP)并测定其体外和体内抗菌活性。体外抑菌试验结果显示,抗菌肽MLP对鸡致病性大肠杆菌O 1、猪致病性大肠杆菌K 99(A TCC39302)、鸡白痢沙门菌(ATCC10398)、猪霍乱沙门菌(ATCC13312)、禽多杀性巴氏杆菌(CVCC474)和金黄色葡萄球菌(ATCC29213)均具有很好的抑菌活性,其对这6种细菌的最小抑菌浓度分别为1.56、6.25、3.12、6.25、1.56和12.5 g/m L。酸稳定性试验结果显示,抗菌肽MLP在p H值为5~6时活性最高。热稳定性试验结果显示,抗菌肽MLP 100℃加热40 min后仍具有抑菌活性。在对雏鸡感染鸡大肠杆菌和小鼠感染金黄色葡萄球菌的体内疗效试验中,抗菌肽MLP显示了较好的治疗效果。本研究为临床上设计有效的Metalnikowin类抗菌肽提供了参考数据。     

复方庆大霉素注射液的质量控制及体外抑菌效果

为制备复方庆大霉素注射液,对其进行质量控制方面的测定,同时进行注射液的体外抑菌试验,以便给临床应用提供理论依据。通过预实验和L9(33)正交设计优化制备处方。对复方庆大霉素注射液分别进行澄明度检查、p H值检查、热原检测试验等质量控制研究。通过对患乳房炎母猪的乳汁进行细菌分离培养和生化鉴定,采用二倍管稀释法测定复方庆大霉素注射液和庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的MIC和MBC。结果,复方庆大霉素注射液的最优配方为:每50 m L注射液中硫酸庆大霉素为1 g,氟尼辛葡甲胺为0.01 g,助溶剂N,N-二甲基甲酰胺为6%,稳定剂聚乙二醇为3%,抗氧化剂无水亚硫酸钠为0.06%。质量控制结果显示,注射液澄明度检查未检出可见异物,p H在7.0~7.5,无热原出现。从患猪奶样中分离出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌。体外抑菌试验结果表明,复方庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的MIC分别是1.18、2.35、4.70 g/m L;庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的MIC分别是2.35、4.70、9.39 g/m L。复方庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的MBC分别是2.35、9.39、9.39 g/m L;庆大霉素注射液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的MBC分别是4.70、18.78、18.78 g/m L。结论:确定了复方庆大霉素注射液配方,质量控制符合注射液要求,对常见的病原菌具有良好的抑菌效果。     

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响

为了探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比(MOI)为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。     

马齿苋多糖对猪流行性腹泻病毒抑制作用的研究

提取马齿苋多糖(POP),研究它对猪流行性腹泻病毒(PEDV)体外复制的作用及机制。采用醇沉法提取POP并用纯化,选用VH细胞为模型细胞,检测纯化后的多糖对该细胞的细胞毒性。用PEDV感染VH细胞,建立体外病毒感染模型,用CCK-8和RT-q PCR的方法检测POP对细胞的保护和对病毒的抑制效果以及作用于病毒感染的时期,免疫荧光观察其对病毒复制的作用,并通过ELISA方法检测POP对体外PEDV感染模型分泌IFN-α、TNF-α、IL-6等细胞因子的影响。结果显示,POP浓度在0～25 μg/m L范围内对VH细胞无毒副作用;浓度为6.25～25 μg/m L时对PEDV具有明显的抑制作用,并呈一定的剂量依赖性,免疫荧光可以清晰观察到其对病毒复制的抑制作用。该药物主要作用于病毒感染的吸附期;其对PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌的抑制作用显著(P0.01)。由此得出:POP对PEDV感染的VH细胞具有明显的抑制作用,能抑制PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α、IL-6的蛋白含量的增加,从而发挥抗病毒的作用。     

鸭源葡萄球菌的分离鉴定和毒力基因检测及其与致病性相关性研究

为了解广西部分地区鸭源葡萄球菌的流行状况、毒力基因分布情况及致病性,采集该地区送检病鸭组织,进行葡萄球菌分离鉴定,并用PCR方法检测7个代表性毒力基因。结果显示,自送检病料中分离鉴定出39株葡萄球菌,伪中间型葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、溶血葡萄球菌、猪葡萄球菌、阿尼蒂斯葡萄球菌、科氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌分别有8、18、2、1、3、3、3、1株。毒力基因检测结果显示,鸭源葡萄球菌各菌种间毒力基因分布存在差异,金黄色葡萄球菌携带毒力基因较全,其次是伪中间型葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、溶血葡萄球菌、猪葡萄球菌、阿尼蒂斯葡萄球菌、科氏葡萄球菌和表皮葡萄球菌。致病性试验结果显示,金黄色葡萄球菌和伪中间型葡萄球菌均可使小鼠产生皮肤化脓、致死,比率高于其他分离菌株,表明其对小鼠有强致病力。本研究结果表明广西地区存在葡萄球菌感染,其中金黄色葡萄球菌和伪中间型葡萄球菌毒力基因分布多,且致病性强。     

金黄色葡萄球菌噬菌体SP-2裂菌特性分析

为筛选高效裂解金黄色葡萄球菌的专性噬菌体，有效防控养殖场耐药病原菌感染，本研究采集奶牛场粪水样本，利用实验室培养的金黄色葡萄球菌分离裂解性噬菌体，鉴定分析噬菌体的理化特征和生物学特性，测定裂菌效率及裂菌谱；通过模拟污染地面，研究该噬菌体的环境杀菌潜力。结果显示，分离到1株双链DNA噬菌体SP-2，属于短尾噬菌体科（Podoviridae），裂菌谱广，不仅能裂解实验室耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），而且对食源性及医院临床分离的金黄色葡萄球菌也有很好的裂解作用；在体外杀菌试验中，噬菌体SP-2可在3 h内裂解MRSA菌株PNB25；环境消毒模拟试验结果显示，经噬菌体SP-2喷雾处理后，对平板内细菌的杀菌效率高达90.8%。结论，噬菌体SP-2对金黄色葡萄球菌具有高效、种内广谱的裂解作用，有望成为防控金黄色葡萄球菌感染的一种抗菌制剂及环境消毒剂。     

金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖偶联抗原的制备及免疫原性分析

为建立金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)纯化与偶联技术方法,获得具有免疫原性的CP5偶联抗原,采用高压破碎菌体的方法释放荚膜多糖,酶处理去除核酸和蛋白质,通过离子交换层析进一步纯化,得到纯化的CP5,并对其纯度和反应原性进行检测;采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法制备CP5-牛血清白蛋白(CP5-BSA)偶联抗原,加佐剂免疫小鼠,进行抗体水平测定。结果表明,纯化的CP5纯度为675.1g/kg,经用免疫琼脂双扩散试验检测,纯化多糖仅与同型菌株抗血清发生沉淀反应,偶联抗原CP5-BSA可以刺激小鼠产生CP5免疫应答。此研究结果为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研制提供了试验依据。