妊娠期绵羊子宫内膜Fit-1基因表达的RT-PCR检测

以β-actin基因作为内源性内标,采用RT-PCR方法检测了Flt-1基因mRNA在东北细毛羊、小尾寒羊妊娠期不同阶段子宫内膜中的表达量.结果显示,绵羊妊娠期在不同阶段的子宫内膜中Flt-1 mR-NA均强烈表达,且随着妊娠期的延长,Fit-1 mRNA的表达量有逐渐增强的趋势(P＜0.05);在相同的妊娠阶段小尾寒羊子宫内膜中的Flt-1 mRNA表达量显著地高于东北细毛羊的Flt-1 mRNA表达量(P＜0.05).     

enJSRV囊膜蛋白激活绵羊绒毛膜滋养层细胞中MAPK信号通路的研究

为初步探究内源性绵羊肺腺瘤病毒(en JSRV)囊膜蛋白(Env)在绵羊绒毛膜滋养层细胞中的作用机制,利用免疫组织化学染色法检测enJSRV-Env在绵羊胎盘中的主要表达区域,继而瞬时转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env到绵羊绒毛膜滋养层细胞,并加入Erk抑制因子PD 98059、p38抑制因子SB 203580及JN K抑制因子SP600125,同时转染重组质粒至293T细胞中作为对比。利用W estern-blot分别检测2种细胞中Erk1/2、p38和JNK蛋白激酶磷酸化水平的变化。免疫组织化学染色结果显示,enJSRV-Env主要表达于绵羊胎盘中绒毛膜滋养层细胞。Western-blot结果显示,绵羊绒毛膜滋养层细胞中,转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRV-env组中p-Erk1/2、p-p38和p-JNK的表达量均显著高于对照组和加入抑制因子组(P0.05);加入3种抑制因子后,3种蛋白激酶的磷酸化水平较转染组显著降低。293T细胞中,转染重组质粒pEGFP-C1/en JSRVenv组中p-p38的表达量显著高于对照组(P0.05),p-JNK的表达量极显著高于对照组(P0.01)。因此,enJSRV-Env激活了绵羊绒毛膜滋养层细胞中MAPK信号转导通路。再通过与293T细胞的结果对比可知,enJSRV-Env在这2种细胞中的作用机制有所不同。本研究为今后继续深入探究en JSRV-Env的作用机制提供了新的思路和依据。     

雌激素受体在间情期绵羊输卵管上皮细胞中的表达

为探讨膜性雌激素受体GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1)及雌激素核受体ERα、ERβ在绵羊输卵管上皮细胞中的表达和定位,探讨三种受体在间情期绵羊输卵管中的表达规律,通过RT-qPCR方法和免疫印迹方法分别检测了三种受体基因mRNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组化法对输卵管组织中三种受体基因进行定位并对结果进行光密度值分析。结果,输卵管上皮细胞中GPER相对表达量高于ERα、ERβ(P0.01),ERα的相对表达量高于ERβ(P0.05)。免疫组化结果显示,GPER广泛分布于绵羊输卵管上皮细胞中,主要定位于细胞膜及细胞质。而ERα及ERβ主要分布于绵羊输卵管上皮细胞的细胞核。阳性细胞光密度分析结果与荧光定量RT-qPCR的分析结果相一致。上述结果表明,间情期绵羊输卵管上皮细胞中同时存在GPER、ERα、ERβ三种雌激素受体表达,且GPER的平均光密度、mRNA相对表达量最高,ERβ的平均光密度、mRNA相对表达量最低。     

绵羊生殖器官GDF9基因的表达研究

生长分化因子9(GDF9)是绵羊多胎性状的重要候选基因,探讨GDF9在不同发育时期的母羊生殖器官的表达规律,对揭示其调控母羊生殖器官的发育具有重要的意义。以2月龄(性成熟前)、6月龄(性成熟)和12月龄(性成熟后)这3个不同生理阶段的雌性绵羊卵巢、输卵管、子宫内膜为对象,采用RT-PCR技术分析GDF9蛋白在相应生殖器官中的表达,并分析其相对表达量;采用免疫组织化学法对GDF9基因在相应生殖器官中的表达进行定位分析。荧光定量PCR结果显示,GDF9在2月龄与6月龄间、2月龄与12月龄间的卵巢上均表现出极显著的差异性(P0.01),而6月龄与12月龄则无显著性差异(P0.05);GDF9在2月龄与6月龄间的子宫内膜上表达无显著差异(P0.05),而在2月龄与12月龄间、6月龄与12月龄间的子宫内膜上的表达均差异显著(P 0.05);GDF9在3个年龄间的输卵管上的表达均无显著性差异(P0.05)。免疫组织化学试验结果显示,GDF9蛋白在2月龄、6月龄和12月龄绵羊子宫内膜和输卵管的上皮细胞及卵巢的颗粒细胞上均能表达,说明GDF9在不同生理阶段的绵羊生殖器官上表达且存在特异性细胞定位。     

藏羊肺组织形态测量指标及其与高原低氧的关系

比较观察和测量了高原藏羊和平原小尾寒羊的肺组织结构,并就藏羊肺组织形态测量指标与高原低氧的关系进行了初步探讨。结果表明,藏羊肺组织在肺泡大小、单位面积肺泡数和细小血管数、肺泡隔的厚度、肺泡隔内弹性纤维含量和毛细血管数量、终末细支气管的管径及细小动脉管壁中弹性纤维和平滑肌的含量等方面与小尾寒羊的肺组织相应值比较,表现有一定的差异和特点,这些差异和特点正是藏羊肺组织适应高原低氧的形态学特点。     

哺乳动物雄性生殖系统β-防御素的研究进展

β-防御素是哺乳动物体内一种重要的抗菌肽,广泛分布于黏膜上皮细胞和中性粒细胞中,在先天性免疫和获得性免疫中具有重要作用。近年来,β-防御素(beta-defensin,DB)被发现在哺乳动物雄性生殖系统中广泛表达,并参与对抗生殖系统微生物的感染,维持附睾上皮、附睾腔内的环境稳定,发挥抑菌抗炎的作用,同时与精子结合,调节精子的功能,参与动物有效生殖。迄今为止,雄性生殖系统β-防御素在人及鼠等物种的研究比较深入,但在其他哺乳动物的研究还很有限。本文结合已有的研究成果对β-防御素在哺乳动物雄性生殖系统的表达分布、参与哺乳动物有效生殖的方式和机制进行了综述,并对其应用前景做出展望。     

不同繁殖周期成年牦牛睾丸细胞外基质相关蛋白的分布比较

应用Masson三色染色法、Gomori银浸染色法以及免疫组织化学SP法结合IPP统计分析法,比较了层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)和硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)在繁殖期和繁殖间期牦牛睾丸的分布及组织化学特征。结果,不同繁殖期牦牛睾丸间质胶原纤维及网状纤维均较为丰富;繁殖间期牦牛睾丸LN在支持细胞(sertoli cells)和生精细胞表达与繁殖期相近,在间质细胞(leydig cells)表达降低,但其平均吸光度检测无统计学差异(P0.05);ColⅣ在不同繁殖期牦牛睾丸支持细胞和各级生精细胞均有阳性表达,但繁殖期牦牛ColⅣ在近管腔面生精细胞显示有强阳性表达,平均吸光度统计表明繁殖期显著高于繁殖间期(P0.01);HSPG在不同繁殖期牦牛睾丸精原细胞及支持细胞强阳性表达,繁殖间期平均吸光度检测极显著低于繁殖期(P0.01)。上述研究结果表明,高原环境中成年牦牛睾丸间质组织纤维成分随繁殖季节变化并不明显,睾丸组织LN合成与不同繁殖季节间质细胞分泌功能变化相关,繁殖期ColⅣ合成增强更有利于精子生成,HSPG的显著增加主要与精原细胞及支持细胞分化相关。     

绵羊铅镉联合中毒的病理学研究

用普通光镜和电镜观察及元素分析等方法对白银工业污染区绵羊进行了系统研究。形态观察表明，该地区绵羊有明显的中毒变化，特征为牙的损伤，皮下水肿，全身小动脉壁的玻璃样变，肺漫性肺泡隔炎、支气管与血管周围炎及片状纤维组织增生，肝细胞变性、坏死，中毒性肾病、近曲小管上皮内核内包涵体及亚急性肾小球肾炎。主要的超微结构变化是肺Ｉ型上皮的变灶和坏死、Ⅱ型上皮增生及肺泡隔胶原形成，肝细胞线粒体变性和肿胀、滑面内质网增生及过氧化物体增多，肾小管上皮内细胞器变性。元素分析发现，中毒羊心、肝、脾、肺、肾、肋骨、四肢骨、牙齿、全血及被毛铅含量显著高于健康羊（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），肝、肾、肺及毛镉含量亦高于正常（Ｐ＜０．０１），主要脏器铅、镉含量达到或超过动物铅、镉中毒的诊断指标。因此认为，白银工业污染引起了绵羊铅、铅镉联合中毒。     

高原甘加藏羊发情周期GnRHR基因在垂体和卵巢表达规律的研究

探究高原甘加藏羊发情周期促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因在垂体和卵巢组织中的表达规律,选取处于繁殖期健康未孕高原甘加藏羊48只,分为4组,每组12只,分别于发情前期、发情期、发情后期、间情期从甘加藏羊垂体和卵巢组织中提取总RNA,应用荧光定量RT-PCR方法,以GAPDH为内参,研究高原甘加藏羊发情周期垂体和卵巢组织中GnRHR基因表达的差异。结果显示:高原甘加藏羊整个发情周期不同阶段GnRHR mRNA在垂体和卵巢组织中均有表达。在甘加藏羊发情前期、发情期、发情后期、间情期垂体组织中GnRHR mRNA的相对表达量依次为0.8246±0.1739、1.5100±0.4187、0.2923±0.0202、1.0000±0.2100,其中发情期的相对表达量最高,与发情后期差异极显著(P0.01),与发情前期、间情期差异显著(P0.05);在卵巢组织中,GnRHR mRNA的相对表达量分别为1.0910±0.7665、0.5420±0.0763、1.3799±0.7452、1.0000±1.1221,其中发情后期的相对表达量最高,与发情期差异极显著(P0.01),与发情前期、间情期差异显著(P0.05)。这一研究结果为在分子水平上研究藏羊生殖活动调控机理提供了科学数据。     

妊娠绵羊子宫内膜组织内源性反转录病毒及其受体HYAL2基因表达水平的检测

为了探究内源性反转录病毒(enJSRV)及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊子宫内膜形成和发育过程中的作用,运用TaqMan实时荧光定量PCR和组织原位杂交技术对其在不同妊娠时期(30、50、70、90、110和130d)蒙古绵羊子宫内膜中的表达规律和分布定位进行了研究。实时荧光定量PCR结果显示,enJS-RV及其受体HYAL2在蒙古绵羊子宫内膜的不同妊娠时期均有表达,通过SPSS统计学软件分析可以看出,妊娠蒙古绵羊子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达于妊娠第30和50天相对较高,70～130d均低于对照组(30d),且差异都极显著,enJSRV与其受体HYAL2mRNA之间亦无线性相关性。原位杂交结果显示,enJSRV及其受体HYAL2mRNA在妊娠第30、50和130天蒙古绵羊子宫内膜的腔上皮细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞、间质及滋养层巨型双核细胞中均有阳性信号表达。表明enJSRV及其受体HYAL2表达于上皮细胞及上皮细胞来源的滋养层巨型双核细胞中,揭示enJSRV及其受体HYAL2在子宫形成过程中和系统防御中可能发挥重要作用。     

小鼠Ghrelin基因真核表达质粒的构建及对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

为构建小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒,并研究Ghrelin对3T3-L1细胞增殖的影响,以小鼠肠cDNA为模板,通过PCR扩增Ghrelin基因,插入到pMD18-T克隆载体中。对经鉴定的重组质粒pMD-Ghrelin进行双酶切,将目的基因连接到经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用Lipofectamine 3000转染试剂将重组表达质粒转染到3T3-L1细胞中,采用qRT-PCR和Real-time PCR检测Ghrelin基因在3T3-L1细胞中的表达。采用CCK-8法检测细胞的生长活力;流式细胞术检测Ghrelin基因对细胞周期和凋亡的影响;采用Real-time PCR检测部分周期相关基因的mRNA表达水平。结果显示,成功构建了小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Ghrelin,并能在3T3-L1细胞中得到很好地表达,其表达倍数是空质粒组的5倍(P0.01);转染后第48、72和96小时,Ghrelin转染组3T3-L1细胞的生长活力明显高于空载体组(P0.05或0.01);转染后第24小时,Ghrelin转染组S期细胞数量明显高于空载体组(P0.05);Ghrelin过表达对3T3-L1细胞的凋亡无明显影响(P0.05)。qRT-PCR结果显示,Ghrelin转染组细胞的c-myc(P0.05)、E2F1、CDK2(P0.05)等mRNA的表达量也明显高于空载体组,P53表达低于空载体组,差异显著(P0.05)。以上结果表明,Ghrelin过表达能显著促进3T3-L1细胞的增殖,但不影响凋亡。     

VEGF在绵羊性成熟前后睾丸组织中表达水平的比较分析

为探索血管内皮生长因子(VEGF)在绵羊睾丸发育和精子发生过程中的作用,本研究以绵羊性成熟前后睾丸组织为研究对象,采用RT-PCR和Western-blot方法检测VEGF m RNA及其蛋白在绵羊性成熟前后睾丸组织中的表达差异,利用SSPS 18.0对数据进行比较分析。结果显示,VEGF m RNA及其蛋白在绵羊性成熟前后睾丸组织中均有表达,二者在性成熟后睾丸中的表达量明显高于性成熟前睾丸(P0.05),且VEGF m RNA与蛋白的表达趋势趋于一致。由此可见,VEGF在绵羊睾丸发育和精子发生过程中具有促进作用,这为进一步探索VEGF在睾丸中的作用机制奠定了一定的理论基础。     

不同发育期大通牦牛组织线粒体COX基因的分析

采用绝对定量荧光PCR(Real-Time PCR),对妊娠4月、出生1日、1月、3月和6月龄不同发育期的青海大通牦牛组织中线粒体COX-Ⅰ及COX-Ⅱ的mRNA表达量进行分析。结果显示,不同发育期牦牛大脑、心肌、骨骼肌、肝组织线粒体COX-ⅡmRNA表达量均高于COX-ⅠmRNA表达量;COX-ⅡmRNA表达量与COX-Ⅰ相比较稳定。妊娠4月龄大脑组织线粒体COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量均显著高于其他年龄组(P0.05);1日龄心肌组织线粒体COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量均显著高于其他年龄组(P0.05);1月龄骨骼肌组织线粒体COX-Ⅰ、ⅡmRNA表达量均显著高于其他年龄组(P0.05);6月龄肝组织线粒体COX-ⅠmRNA表达量最高,差异显著(P0.05);而肝组织线粒体中COX-ⅡmRNA表达量在各个年龄段差异不显著(P0.05)。结果表明,大通牦牛生长发育阶段妊娠4月龄胎儿大脑组织、出生1日龄心肌组织及1月龄骨骼肌组织COX亚基mRNA转录水平均表现为上调表达,这与组织器官处于快速发育阶段及与其发挥重要的功能有直接关系。     

高原甘加藏羊发情周期垂体FSH β和LH β mRNA表达差异的研究

为了研究高原甘加藏羊发情周期垂体组织中促卵泡素β亚基(FSHβ)和促黄体素β亚基(LHβ)基因在m RNA水平的表达规律,选取发情周期不同阶段的高原甘加藏羊24只,从其垂体组织中提取总RNA,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,以β-actin为内参基因,比较研究了高原甘加藏羊发情周期垂体组织中FSHβ和LHβ基因在m RNA水平的表达差异。结果显示,FSHβ和LHβ的m RNA在高原甘加藏羊发情周期不同阶段的垂体组织中均有表达。发情前期、发情期、发情后期和间情期的FSHβm RNA相对表达量分别为0.235 9、1.0、3.547 5和3.666 7,发情前期与发情期、发情后期和间情期差异极显著(P0.01),发情期与发情后期和间情期差异显著(P0.05),发情后期与间情期差异不显著(P0.05);LHβm RNA相对表达量为0.025 9、1.0、16.109 1和0.563 8,发情前期与发情期、发情后期和间情期差异极显著(P0.01),发情期与发情后期差异极显著(P0.01)、与间情期差异不显著(P0.05),发情后期与间情期差异极显著(P0.01)。因此,甘加藏羊发情周期内垂体组织中FSHβ和LHβ在m RNA水平上的表达呈现一种动态差异性变化趋势。本研究结果在分子水平上为揭示藏羊生殖内分泌调控机制提供了科学数据。     

L-PGDS基因在大鼠睾丸与附睾中的表达

选用 2月龄SD大鼠睾丸与附睾总RNA为模板 ,运用RT PCR和蛋白质印迹技术探讨了Lipocalin型前列腺素D合成酶 (L PGDS)基因在大鼠睾丸与附睾头、附睾体和附睾尾中的表达及其差异。结果表明 ,L PGDS基因在大鼠睾丸中没有表达 ,在附睾中有较强表达 ,附睾头表达量最高 ,附睾体次之 ,附睾尾最低 ,表达量存在差异。提示 ,L PGDS在精子成熟过程中起着一定的作用。     

绵羊SP-A基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

肺表面活性蛋白A(surfactant protein A,SP-A)具有维持肺内稳态、防御病原感染以及协助免疫应答等重要作用。本试验建立了定量检测绵羊SP-A基因及内参基因B2M(beta 2 microglobulin)m RNA表达水平的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法,并采用该方法对健康滩羊、小尾寒羊和滩寒杂交羊三个绵羊品种肺脏中SP-A m RNA的表达情况进行了检测。结果显示,SP-A基因和B2M基因的扩增效率分别为94.1%和95.9%;线性范围分别在1×10-1~1×10-6和1×10-1~1×10-7;相关系数分别为0.998和0.999;熔解曲线分别在84.5℃和83.0℃出现一个特异峰;滩羊SP-A m RNA的表达水平略高于小尾寒羊和滩寒杂交羊。本试验建立的绵羊SP-A基因实时荧光定量RT-PCR方法特异性好、检测线性范围广,为绵羊SP-A m RNA表达水平的检测提供了重要方法。     

绵羊下丘脑催产素神经元分布的研究

催产素(oxytocin,OXT)在动物分娩、维持哺乳方面具有重要作用,近年来发现OXT对能量代谢亦具有积极作用。尽管OXT在小鼠、大鼠、猕猴等动物脑部有广泛的分布表达,但OXT在绵羊下丘脑的表达部位和神经投射通路尚无报道,成为限制研究其生物学功能的瓶颈之一。本试验以绵羊下丘脑为主要研究材料,运用免疫荧光技术明确了OXT神经元在下丘脑的表达分布。结果显示,OXT神经元集中分布在绵羊下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN)区域,在视上核(supraoptic nucleus,SON)有零星表达,且均具有较为明晰神经元胞体及纤维结构,这种分布与小鼠的表达部位呈现高度一致。上述结果为进一步研究OXT在绵羊能量代谢方面发挥的生物学作用奠定了免疫学基础。     

双酚A对雄性小鼠睾丸发育和生殖激素分泌水平的影响

为研究不同剂量的双酚A(BPA)对雄性小鼠生殖系统的损伤作用,将25g左右的雄性小鼠40只随机分成对照组、BPA(10、50、100mg/kg)染毒组,每组10只,连续7d对小鼠腹腔注射BPA,对照组注射等量的橄榄油,1次/d,染毒结束后摘取并称量大鼠睾丸、附睾质量并计算脏器指数;光镜检测睾丸病理学改变;酶联免疫法检测血中睾丸酮、黄体生成素水平。结果显示,与对照组相比,小鼠睾丸重量、附睾重量及其脏器指数显著降低(P0.05,P0.01);双酚A组中的曲细精管部分支持细胞与生精细胞分离,生精细胞松散,无规律,各层细胞发生紊乱;随染毒剂量的增加,小鼠血清中睾丸酮和黄体生成素的含量逐渐降低,50mg/kg和100mg/kg两个剂量组睾丸酮和黄体生成素的浓度与对照组相比差异极显著(P0.01)。结果表明BPA可引起雄性小鼠生殖系统的损伤。     

绵羊肺炎支原体P108蛋白的分子特征分析及免疫原性研究

为进一步探究绵羊肺炎支原体P108蛋白的结构及其免疫原性,在进行生物信息学分析的基础上,对编码P108的部分基因片段进行了PCR扩增、克隆和原核表达,并采用Western-blot方法对其免疫原性进行了分析。结果显示,p108基因与猪肺炎支原体黏附相关基因mhp385的核苷酸同源性较高,扩增的p108部分基因在大肠杆菌BL21(DE3)中成功获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在;重组蛋白可以与山羊抗绵羊肺炎支原体血清发生结合反应,表明P108蛋白是免疫原之一。本研究结果表明P108蛋白可以诱导机体产生免疫应答,是建立绵羊肺炎支原体感染血清学诊断技术的潜在抗原。     

胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化的影响

对分离自20日龄雄性SD大鼠附睾和肾周白色脂肪组织的前体脂肪细胞进行原代培养,并采用MTT比色法、油红O染色提取法分析了100~400 nmol/L胰岛素对其增殖、分化的影响,同时利用半定量RT-PCR分析了该浓度胰岛素对分化标志基因———脂肪酸合酶(FAS)、乙酰CoA羧化酶α(ACC1)基因mRNA表达的影响。结果显示,胰岛素能有效地促进前体脂肪细胞的增殖和分化(P<0.05),在400 nmol/L以下具有剂量依赖性;胰岛素处理72 h能显著提高脂肪细胞FAS和ACC1基因mRNA的表达水平(P<0.05)。证实胰岛素对原代培养大鼠前体脂肪细胞增殖分化有明显促进作用。