犬源环孢子虫PCR检测方法的建立

为了建立犬源环孢子虫的PCR检测方法,根据该环孢子虫18SrDNA基因序列,设计1对特异性引物;通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件,进行了特异性和敏感性试验;并对临床样品进行了检测。结果显示,该PCR检测方法能特异性地扩增出犬源环孢子虫18SrDNA中379bp的片段,与牛源环孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、人隐孢子虫、蓝氏贾第虫、刚第弓形虫、毛首线虫、大片吸虫、犬弓首蛔虫等8种虫体基因组DNA无交叉反应;最低能检测到84fg的阳性参照DNA,检测的157份临床样品中8份为阳性,比传统镜检方法多出3份。结果表明,建立的PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于犬环孢子虫的临床检测。     

微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫SYBR Green real time PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的隐孢子虫小亚基rRNA基因序列设计1对引物,并以标准基因组DNA为模板,初步建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的SYBR Green real time PCR方法,并对乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫阳性样品和上海40份乳牛粪便进行了检测.结果表明,此次建立的real timePCR对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫均能扩增出曲线,且其他寄生虫(鸡贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫)和大肠杆菌均未检测到;标准基因组DNA的检测阈值达到5个拷贝,牛粪中卵囊的最低检测量为每克粪便5个卵囊,乳牛粪便阳性率为15%(6/40).表明,建立的荧光定量PCR快速、特异、敏感,可用于乳牛隐孢子虫病的流行病学调查.     

猪四种病毒性腹泻病原多重PCR检测方法的建立及应用

分别以猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因、猪轮状病毒(Po RV)VP6基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因、猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Npro基因为靶基因,参照Gen Bank上登录的基因序列,利用DNAStar和Oligo7软件设计了4对引物。采用PCR分别扩增各病毒基因,并克隆至p MD18-T载体,获得4个阳性重组质粒。以重组质粒为模板,进行多重PCR方法的优化。特异性试验检测可分别扩增出相应的病毒基因片段;敏感性试验结果显示,检测PEDV、TGEV、Po RV及BVDV质粒的最低拷贝数分别为730copies/L、547 copies/L、6.47×103copies/L、705 copies/L。应用该方法对猪场44份猪腹泻样品进行检测,结果检出15份PEDV样品,3份TGEV样品,2份BVDV样品,其中PEDV与TGEV混合感染样品2份,TGEV与BVDV混合感染样品1份。随机抽取其中2份PEDV阳性样品进行病毒分离,病毒经细胞传3代以上PCR检测均为阳性,对PCR产物测序证实为PEDV。结果表明,本研究建立的多重PCR方法具有快速、简便、特异性强、敏感度高的特点,能够对PEDV、Po RV、TGEV和BVDV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌二重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌二重TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了检测猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌的二重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,所建方法特异性良好,与其他25种常见细菌均无交叉反应。猪丹毒杆菌检测在2.07×108~2.07×103copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到2.07×102copies/L的标准品阳性质粒,批内和批间变异系数均小于3%;溶血性曼氏杆菌检测在1.07×108~1.07×103copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到1.07×102copies/L的标准品阳性质粒,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的二重荧光定量方法和普通荧光定量方法对47份临床样品进行检测,符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确检测猪溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,优化反应条件,建立了检测溶血性曼氏杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,以重组质粒pMD-MH-16S为标准品建立的标准曲线在3.06×10~8~3.06×10~1copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到3.06×101 copies/L的标准品阳性质粒。该方法与其他24种常见细菌均无交叉反应,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和普通PCR方法对65份临床样品进行检测,阳性率分别为56.92%和21.54%,阳性符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于牛、羊溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

福建猫源弓形虫IgG抗体检测及PCR-RFLP基因分型与遗传变异分析

采用酶联免疫吸附(ELISA)试验对福建某花鸟市场采集的40份猫血液样本进行弓形虫IgG抗体检测,对抗体呈现阳性的血液样品进行弓形虫B1基因PCR扩增;对扩增结果呈现阳性的样本采用多位点巢式PCR-RFLP技术,在SAG1、5’SAG2、3’SAG2、Alt.SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1和Api co共12个位点进行弓形虫基因分型研究和部分位点的遗传变异分析。结果表明,40份血清中,19份血清呈弓形虫IgG抗体阳性,阳性率为47.5%,19份血清抗体呈阳性的血液样品中,B1基因PCR扩增出3份阳性样品,进一步多位点巢式PCR-RFLP分析和遗传变异分析发现,PCR阳性样品中的弓形虫基因型均表现为New Genotype型。     

化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)和溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)快速核酸检测方法,本研究根据化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA保守序列设计2对特异性引物及2条TaqMan探针。经对反应体系和反应条件进行优化,建立了化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示,该方法与金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、肠炎沙门菌和大肠杆菌等22种常见细菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌质粒标准品的最低检出浓度分别为31 copies/μL和65 copies/μL,且变异系数小于3%。对45份临床肺样品的检测结果显示,化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为15.5%和24.4%。本研究建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的检测提供了敏感、快速的方法。     

贵阳动物园动物隐孢子虫的调查与虫种鉴定

为了解贵阳动物园圈养野生动物隐孢子虫的感染流行情况,以骆驼、黑熊、斑马、袋鼠、猕猴、长臂猿、大象等野生动物的新鲜粪便为样品(n=84),采用饱和蔗糖溶液漂浮法收集隐孢子虫的卵囊并提取D N A,以18S r R NA为目标基因靶点设计特异性引物,并采用巢式PCR扩增目的基因,后经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,对检测结果为阳性的PCR产物进行序列分析并建立系统发育树。结果表明,共有13份隐孢子虫阳性样品,其中骆驼7份,感染率为70.00%,感染虫种为安氏隐孢子虫;斑马1份,感染率为10.00%,感染虫种为安氏隐孢子虫;长臂猿5份,感染率为23.81%,感染虫种为微小隐孢子虫、人隐孢子虫及小鼠隐孢子虫。本次调查发现该园野生动物隐孢子虫具有较高的总体感染率(15.50%)和鉴定出4种人兽共患隐孢子虫虫种,具有较重要的公共卫生意义。本研究首次报道了我国斑马感染隐孢子虫。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法的建立

为建立高效快速的丹毒丝菌属荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据丹毒丝菌属16S r RNA基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法。结果显示,标准品浓度在1.06×106~1.06×101copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到1.06×10-2 copies/L的标准品阳性质粒;该方法与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等22种细菌和病毒无交叉反应;批内和批间的变异系数(CV)均小于3%。对临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

副猪嗜血杆菌纳米PCR检测方法的建立

为了建立副猪嗜血杆菌(HPs)的高效纳米PCR检测技术,根据文献合成了1对针对HPs的16S rRNA基因的特异性引物,并对纳米PCR的反应条件进行优化。然后用建立的纳米PCR检测HPs、大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌及猪链球菌2型等猪源细菌以验证该纳米PCR的特异性,同时比较该纳米PCR与普通PCR的灵敏度。特异性试验结果表明,只有HPs能够扩增出822bp的目的片段,其他细菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果显示,建立的纳米PCR的敏感性比普通PCR高10倍,最低可检出4.19×10-6 ng/μL的HPs基因组DNA。结果表明,本研究建立的基于16S rRNA基因的HPs纳米PCR具有较好的特异性和较高的灵敏度,是一种高效、快速的检测方法,可为副猪嗜血杆菌病的防控和检验检疫提供技术支撑。     

鸭疫里默氏杆菌16 S rRNA PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里默氏杆菌(RA)1～19型16 S rRNA基因序列,分别与大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的16 S rRNA基因序列对比,设计特异性引物,建立了基于鸭疫里默氏杆菌16 SrRNA的PCR检测方法.结果表明,用该方法对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌进行检测,只有鸭疫里默氏杆菌的DNA能扩增出680 bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;测序结果与GenBank中鸭疫里默氏杆菌相应序列完全一致;同时分别将鸭疫里默氏杆菌基因组DNA和菌液10倍稀释进行PCR扩增,对鸭疫里默氏杆菌DNA的最小检出量为1.907×10~(-5)g/L,对鸭疫里默氏杆菌菌液的最小检出量为1.5×10~4CFU/mL.证实,建立的基于鸭疫里默氏杆菌16 S rRNA的PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的优点,可用于鸭疫里默氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定.     

伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法的建立

为建立伪结核棒状杆菌可视化LAMP检测方法,根据伪结核棒状杆菌16S rRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计2对引物,通过反应体系和反应条件的优化,建立了伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法,并评价该方法的特异性和敏感性。结果显示,本实验所建立LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h。利用该方法检测大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌等山羊和绵羊常见的15种细菌的DNA样品,结果显示仅伪结核棒状杆菌检测为阳性,其他细菌检测为阴性。该方法对阳性质粒标准品pMD19-Cory的最低检出浓度为4.7 copies/μL。应用建立的LAMP方法和普通PCR方法对128份山羊皮下脓肿样品进行检测,结果显示LAMP方法和普通PCR方法的阳性率分别为21.1%(27/128)和20.3%(26/128),2种检测方法的总符合率为99.2%(127/128)。结果表明,本研究建立的可视化LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速的优点,为山羊和绵羊伪结核棒状杆菌感染的可视化现场快速诊断提供可行方法。     

二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立

为绝对定量检测禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）和鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）,本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针,通过优化引物和探针的浓度及反应条件后,建立了二重ddPCR定量检测ARV和MS方法,并对建立方法的特异性、敏感性和重复性进行测试。结果显示,优化后最佳的引物和探针浓度分别为1.2和0.35μmol/L,最佳退火温度为55℃。特异性检测结果只检出ARV和MS,没有检出其他对照的禽病病原。敏感性检测结果显示,该方法检测ARV及MS重组质粒DNA的检出限分别为微滴数6.3和5.4 copies/μL,检测方法的检出限与单重ddPCR最低检出限相同,敏感性比荧光定量PCR方法高10倍。对3个连续稀释的ARV和MS重组质粒DNA检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对92份病鸡关节囊、喉拭子及肺样品进行检测,二重ddPCR方法检出12份样品呈ARV阳性,9份样品呈MS阳性,其中2份样品呈ARV和MS阳性,A...     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。     

毛皮兽阿留申病毒可视化交叉等温扩增检测方法的建立及初步应用

为建立快速、特异、灵敏的毛皮兽阿留申病毒可视化交叉引物等温扩增检测方法(CPA),以阿留申病毒属内病毒序列为参考,在VP2序列高变区保守区段设计合成4条特异引物。通过优化CPA反应条件,建立了毛皮兽阿留申病毒可视化交叉引物等温扩增检测方法,并进行了特异性、敏感性试验以及对临床样品的检测。结果显示,该方法可扩增水貂阿留申病毒(AMDV)和狐貉阿留申病毒(RFAV),对犬科和水貂组织以及常见病毒无特异性反应;对AMDV、RFAV可视化检测下限分别为5.38×10~2copies/μL、5. 93×10~2copies/μL;对83份临床样品的检测结果显示,其中有16份PCR检测为阴性,CPA、qPCR检测为阳性的样品,表明CPA检测方法优于传统PCR。本试验建立了一种高敏感性、特异性检测毛皮兽阿留申病毒的方法,通过添加荧光染料实现了可视化检测,它更加适合基层兽医站、养殖场进行快速核酸检测。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据伪狂犬病病毒gD、gE基因序列设计2对引物及其对应的探针,通过对引物、探针浓度的优化,建立了猪伪狂犬病病毒野毒和减毒活疫苗株荧光定量PCR检测鉴别方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪博卡病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无扩增曲线。野毒株均出现gD和gE基因扩增曲线,而疫苗株只出现了gD基因扩增曲线,表明该检测方法具有良好的特异性。建立的gD和gE基因标准曲线Ct值和模板终浓度在1×108～1×10 copies/μL范围内均具有良好的线性关系,灵敏度均可达1×10 copies/μL。对39份猪组织样品进行检测,荧光定量PCR检出5份样品猪伪狂犬病病毒gD、gE阳性,表明这5份猪组织样品为猪伪狂犬病病毒野毒感染。常规PCR检出5份猪伪狂犬病病毒阳性,经测序为野毒感染,2种方法符合率为100%。本研究建立的荧光定量PCR可用于猪伪狂犬病病毒的快速检测和流行病学调查。