口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间接ELISA,并进行特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用所建立的间接ELISA对来自四川部分地区的384份山羊血清样品进行检测。结果显示,成功原核表达出42 ku的重组ORFV B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的抗原反应性。间接ELISA最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为5μg/m L,1∶100稀释血清作用2 h,酶标二抗以1∶2000稀释作用30 min,TMB显色时间为15 min。在该优化条件下,D450≥0.31为阳性。该方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。临床样品的间接ELISA检测结果显示,总阳性率为66.67%(256/384),其中未接种过疫苗的羊只抗体阳性率为34.81%(55/158)。上述结果表明,建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测,四川部分地区山羊场羊只感染野毒的概率较大,疫苗免疫效果不佳。     

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性血清特异性识别。以纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,建立了检测PTV抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,重组VP1蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒阳性血清不发生反应。敏感性试验结果表明血清稀释至1∶800时仍检测为阳性。该方法的批内、批间变异系数均小于10%,表明具有较好的重复性。利用建立的方法对633份临床样品进行检测,阳性率是88.10%。选取58份临床样品与间接免疫荧光方法作比对试验,两者的符合率是94.80%。     

猪札幌病毒VP1基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

为了在大肠杆菌中表达猪札幌病毒VP1基因,并以纯化的重组蛋白为抗原建立猪札幌病毒血清抗体ELISA检测方法。采用RT-PCR技术扩增VP1基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,再将所克隆的衣壳蛋白的编码序列亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,将成功构建的原核表达质粒pETSAVCAP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。用纯化的VP1蛋白作为抗原建立了猪札幌病毒血清抗体间接ELISA检测方法并初步用于临床样品的检测。结果显示,猪札幌病毒VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达,Western-blot分析表明该重组蛋白具有良好的反应原性。经对反应条件进行优化,确定间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对从多个省份收集的490份猪血清样品进行检测,阳性率为65.31%。表明,以大肠杆菌表达的猪札幌病毒VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可以用于猪札幌病毒抗体的检测。     

基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究旨在原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的核衣壳(N)蛋白,以重组N蛋白作为包被抗原建立PEDV血清抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。克隆PEDV N基因并将其插入到原核表达载体p ET-28a中,转化BL21感受态细胞进行诱导表达,对表达的N蛋白进行镍柱纯化及Western-blot鉴定;将纯化的N蛋白作为包被抗原并优化反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达得到大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot检测表明N蛋白具有良好的特异性和反应原性。PEDV间接ELISA方法的最优反应条件为抗原包被量每孔0.05 g,血清以1∶200倍稀释,作用1.0 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释,作用1 h,TMB显色时间为25 min。在该优化条件下,D4500.269为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;对96份阳性血清进行检测,敏感性为98.9%。重复性试验表明,批内变异系数0.99%~2.33%,批间变异系数3.54%~6.67%。用本试验建立的体系对临床上164份血清进行检测,阳性率为56.7%,与标准试剂盒的符合率为95.1%。总之,本试验建立的基于原核表达的N蛋白作为检测抗原的PEDV血清间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好,可用于临床PEDV血清抗体的检测。     

非洲猪瘟病毒P54蛋白的真核表达及间接ELISA检测方法的建立

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达出非洲猪瘟病毒P54蛋白。经SDS-PAGE和Westernblot分析后,以P54重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,通过优化各反应条件,建立了检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA方法。结果显示,P54重组蛋白的大小约为25ku;经Western-blot试验证实,它具有良好的抗原性。建立的间接ELISA方法的检测灵敏度可达1∶320,批内、批间变异系数均小于10%。与商品化的非洲猪瘟竞争ELISA试剂盒比较,符合率达100%。用该间接ELISA方法检测其他不同疫病猪的阳性血清样本,结果均为阴性,表明无交叉反应。结果表明,建立的用以检测非洲猪瘟病毒的间接ELISA方法具有敏感性高、重复性好、特异性好的特点。     

猪萨佩罗病毒VP1蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

为建立猪萨佩罗病毒(PSV)的快速检测方法,本试验以重组VP1蛋白为包被抗原建立了检测PSV Ig G的间接ELISA方法。RT-PCR从PSV分离株SHCM2019中扩增VP1基因,将其克隆到原核表达载体p ET28a,对重组质粒pET28a-VP1进行原核表达,经Western-blotting检测后,利用VP1重组蛋白建立检测猪血清中PSV Ig G抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的VP1蛋白分子质量约为40 ku,与预期大小相符,Western-blotting表明,重组蛋白与PSV抗体阳性血清具有良好反应原性。以VP1蛋白为抗原建立的ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清均无交叉反应,特异性好;批内和批间的变异系数均小于10%,重复性好。利用建立的间接ELISA方法对95份猪临床血清样本进行检测,阳性率为44.21%。本研究建立的检测方法为PSV的血清学诊断提供了可靠手段。     

PRRSV M蛋白基因片段的原核表达及间接ELISA检测方法的初步建立

利用PCR方法获得PRRSV M基因,使用原核表达系统p ET-28a(+)-BL21(DE3)诱导表达M蛋白。用表达的M蛋白建立检测PRRSV抗体的间接ELISA。通过特异性试验、阻断试验和重复性试验考查基于重组M蛋白建立的ELISA(M-ELISA)的实用性,同时使用M-ELISA和IDEXX Herd Chek ELISA for PRRSV试剂盒检测收集的400份临床血清样品。结果,用PCR扩增到了PRRSV M基因,获得了重组M蛋白,建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA(M-ELISA);该M-ELISA具有良好的特异性和重复性。400份临床血清的检测结果与IDEXX试剂盒的检测结果的符合率为95.3%。上述结果表明,本研究基于表达的重组M蛋白,成功建立了检测RRSV抗体的间接ELISA。     

尼帕病毒截短G蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

以截短的尼帕病毒（NiV）G基因原核表达产物为抗原建立检测尼帕病毒抗体的间接ELISA检测方法。对编码尼帕病毒G蛋白基因的部分序列进行扩增,将扩增获得的目的片段克隆至原核表达载体pET-30a（+）,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。菌落PCR鉴定后,在最佳诱导条件下表达目的蛋白。用Ni-NTA柱纯化截短的G蛋白,并进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。以纯化的蛋白为抗原建立尼帕病毒抗体间接ELISA检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性、稳定性进行验证。结果显示：成功构建重组质粒pET-30a(+)-NiV-G;表达的尼帕病毒截短G蛋白分子质量为50 ku,与预期值相符;截短的G蛋白能被His-tag抗体、抗尼帕病毒G蛋白粗提IgG识别。以该蛋白为包被抗原建立的间接ELISA检测方法检测已知阳性血清尼帕病毒抗体效价为1︰20 480,裂谷热病毒、西尼罗病毒及克里米亚-刚果出血热病毒阳性马血清的检测结果均为阴性,且该方法批内、批间试验变异系数均小于10%。结果表明,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-NiV-G,并诱导表达尼帕病毒截短G蛋白。以该蛋白建立的尼帕病毒抗体...     

山羊痘病毒ORF103蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

将山羊痘病毒ORF103蛋白基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组ORF103蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western-blot鉴定;用纯化后的重组ORF103蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果,原核表达获得了大小约为35 ku的重组ORF103蛋白;Western-blot结果表明,此重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。山羊痘病毒间接ELISA的优化反应条件为:抗原包被量每孔500 ng,血清以1∶200稀释后作用1 h,酶标二抗以1∶5 000稀释后作用1 h,TMB显色时间为10 min。在该优化条件下,D_(450)≥0.362为阳性,反之为阴性;特异性试验表明,对小反刍兽疫病毒、口疮病毒、马耳他布氏杆菌和产气荚膜梭菌阳性血清的检测结果均为阴性;对60份山羊痘病毒阳性血清进行检测,敏感性为96.6%;重复性试验表明,批内和批间D_(450)值的变异系数分别在1.81%~3.20%和1.34%~7.38%之间;用本研究建立的方法对临床上162份血清进行检测,阳性率为70.4%。上述结果表明,本研究建立的ELISA可用于山羊痘病毒抗体水平的检测。     

小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种能快速、特异、敏感地检测血清中小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的方法,通过RT-PCR方法扩增出1 830bp的小反刍兽疫病毒的H基因,并将其克隆至原核表达载体pET-22b(+)中,进行H基因的重组表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。通过矩阵法优化抗原最佳包被浓度、血清稀释度、最佳封闭剂、酶标二抗的最佳稀释度及孵育时间。结果显示,重组H蛋白(分子质量为68ku)能与PPRV阳性血清发生特异性反应。用建立的间接ELISA与标准竞争ELISA试剂盒检测92份临床样品并进行比较,两者的符合率为94.11%。结果表明,本研究建立的间接ELISA可以用于临床PPRV抗体的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的截短表达及间接ELISA检测方法的建立

为对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M蛋白进行截短原核表达并建立ELISA检测方法,设计引物扩增了含M基因抗原位点的基因片段,并构建了原核表达载体pET-32a-dM;将pET-32a-dM转化大肠杆菌Rosetta(DE3),获得了高效表达,表达产物大小为27ku。蛋白免疫印迹结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原活性。以重组蛋白为抗原建立了间接ELISA检测方法,方阵滴定试验确定重组蛋白抗原的最佳包被质量浓度为13.07μg/mL,血清稀释度为1∶80,酶标抗体1∶4 000稀释。阳性判定标准确立为D450nm≥0.3,反之则判为阴性。建立的ELISA与猪乙型脑炎病毒、胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的阳性血清均无交叉反应,说明它特异性好。批内与批间重复性试验的平均变异系数分别为3.53%及6.82%,说明重复性较好。用该方法检测52份血清,特异性为87.5%,敏感性为90.0%,与商品化ELISA试剂盒的符合率为88.5%。本研究结果表明,截短表达的M蛋白可以作为诊断抗原,建立的ELISA方法完善后可用于PRRSV抗体的检测。     

猴麻疹病毒抗体免疫梳检测方法的建立及应用

为了建立猴麻疹病毒(MeV)抗体的快速检测方法,本研究采用基因工程技术制备MeV的MeV-32基因原核表达产物即重组MeV-32蛋白作为抗原诊断试剂,以期建立免疫梳方法用于特异性检测实验猴血清中抗MeV的抗体Ig G。结果显示,最佳抗原包被量为0.1 mg/m L;制备好的免疫梳均能够特异性检测到相应的猴MeV阳性血清而不与其他病毒血清间发生交叉反应,表明该检测方法特异性强;敏感性分析结果表明,MeV-32蛋白能够敏感地检测到1∶100倍稀释的MeV阳性血清;稳定性和重复性试验结果表明,同一样品重复检测3次,变异系数(CV)均小于10%;利用该检测方法在对10份可疑猴血清样品进行检测,免疫梳方法与ELISA检测结果一致率为100.0%,Kappa=1.000。上述结果表明,该检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,具有良好的实用性。     

H5亚型猪流感病毒HAl重组蛋白的制备及间接ELISA检测方法的建立

利用化学合成技术合成H5亚型猪流感病毒(SIV)的HA1基因,克隆到原核表达载体Pet-28a( ),构建了重组表达质粒pET28a-HA1/H5,用重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,以镍螯合层析纯化表达蛋白;通过优化反应条件,建立了基于HA1重组蛋白的H5亚型SIV抗体间接ELISA(iHAI-ELISA)检测方法.SDS-PAGE分析结果显示,在大肠杆菌中成功表达了分子质量为45ku的His-HA1融合蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在;Western-blot分析结果显示,表达蛋白能被抗His单克隆抗体和抗H5亚型SIV阳性血清特异识别.优化iHAI-ELISA中HA1/H5重组蛋白的包被浓度为0.31 μg/mL,待检血清的最佳稀释度为1:100.特异性测定结果显示,iHAI-ELISA方法不与H1、H3、H9亚型猪流感病毒抗体以及猪圆环病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒阳性血清发生交叉反应;iHAI-ELISA方法与血凝抑制试验的符合率达93.5%.表明利用重组HA1蛋白建立的检测H5亚型SIV抗体的ELISA方法具有良好的特异性和敏感性.     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

小反刍兽疫病毒N蛋白主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了建立可特异性地检测血清中抗小反刍兽疫病毒(PRRV)抗体的方法,对具有小反刍兽疫病毒特异性的N蛋白第Ⅳ区域进行扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,用于小反刍兽疫病毒N亚单位重组蛋白的表达。用纯化的重组蛋白作为检测抗原,建立了检测血清中抗小反刍兽疫病毒抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA的抗原包被量、血清稀释倍数、血清孵育时间等反应条件进行了优化。Western-blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的反应原性。所建立的间接ELISA方法可以鉴别血清中的小反刍兽疫病毒抗体和牛瘟病毒抗体,具有良好的特异性和灵敏性,与标准竞争ELISA试剂盒的符合率达98.4%。证实,本研究建立的检测血清中抗PPRV抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性和灵敏性。     

口疮病毒B2L蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

将口疮病毒(orf virus,ORFV)ORFV B2L蛋白基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+)中进行重组B2L蛋白的诱导表达;对纯化复性后的B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测血清ORFV抗体水平的间接ELISA,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果,原核表达出42 ku的重组B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。最佳优化反应条件为:抗原包被量每孔600 ng,血清以1∶200倍稀释作用1 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释作用30 min,TMB显色时间为10 min。在该优化条件下,D_(450)≥0.342为阳性,D_(450)0.342为阴性;特异性试验表明,此间接ELISA对其他阳性血清的检测结果为阴性;对121份阳性血清进行检测,敏感性为99.2%;重复性试验表明,批内和批间D_(450)值的变异系数分别在1.81%~6.23%和1.70%~7.45%之间。本试验建立的体系对临床上676份山羊血清样品进行检测,阳性率为99.4%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测。     

猪巨细胞病毒gB基因优势抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立

扩增了猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因的优势抗原表位区,将构建成功的gB基因优势抗原表位区原核表达重组质粒(pET32a-gB)转化入表达菌Rosetta(DE3)中进行表达,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测PCMV抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA检测方法进行了优化。结果显示,最佳抗原包被浓度为1.9μg/mL,最佳血清稀释度为1∶160,二抗最佳稀释度为1∶10 000;当样品D450nm≥0.26时判为阳性,当样品D450nm<0.215时判为阴性,介于两者之间时判为可疑。用该间接ELISA方法对138份PCMV阴性血清与240份PCMV阳性血清进行检测的结果显示,它的特异性为97.83%,敏感性为97.9%,变异系数均小于10%。用该ELISA方法和Western-blot对184份临床样品进行检测,结果二者的符合率为92.4%。结果表明,该间接ELISA方法简便快捷,具有良好的特异性、敏感性及重复性,适用于对PCMV抗体的大规模检测。     

基于牛布氏杆菌重组外膜蛋白的混合抗原间接ELISA方法的建立

为建立布鲁菌的快速检测方法,通过引物设计、PCR扩增、表达载体构建、SDS-PAGE和Western-blot分析对牛布鲁菌3种外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28基因进行原核表达,利用亲和层析法纯化3种重组蛋白,将3种重组蛋白混合作为包被抗原,经重复性、灵敏度和特异性试验建立了布鲁菌抗体检测间接ELISA,并对300份牛血清样品进行检测应用,同时使用进口的商品化试剂盒进行平行检测。结果显示,成功构建了p Cold-TF/OMP19、p Cold-TF/OMP22和p Cold-TF/OMP28原核表达载体,诱导后分别表达大小分别为69、74和80 ku的可溶性且具有良好反应原性的重组蛋白r OMP19、r OMP22和r OMP28。基于此3种重组蛋白混合抗原建立的间接ELISA具有良好的重复性和特异性,其灵敏度达1∶1 600。临床样品检测试验结果显示,与进口试剂盒总符合率高达96%(288/300),其中阳性符合率为93.5%(58/62),阴性样品符合率为96.64%(230/238)。将3种重组外膜蛋白联合作为包被抗原进行牛布鲁菌抗体检测,为我国牛布鲁菌病的诊断检测技术相关研究提供了新的思路和参考。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

采用PCR方法从牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)Bartha Nu/67株扩增出完整的gB基因编码区,将其克隆到pGEM-T Easy载体。根据抗原性将gB基因分成3段,分别克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析。结果显示,目的蛋白均获得了高效表达,均以包涵体形式存在,纯化后目的蛋白的纯度在90%以上。Western-blot和ELISA分析表明,重组蛋白pET-gBⅢ的反应原性最好。以纯化的pET-gBⅢ为诊断抗原包被酶标板,建立了检测BHV-1抗体的间接ELISA方法。用该间接ELISA与法国IDEXX公司的IBR抗体检测试剂盒对临床样品进行平行检测,结果二者的总符合率为93.8%。表明建立的gBⅢELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

山羊关节炎-脑炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)血清抗体的间接ELISA方法,采用PCR方法扩增山羊关节炎-脑炎病毒CA蛋白编码基因序列,然后克隆至原核表达载体pET-28a(+),诱导含有重组载体pET-28a(+)-CA的大肠杆菌BL21(DE3)表达重组蛋白rHis-CA。采用Ni柱亲和层析方法纯化重组蛋白rHisCA,并以纯化的rHis-CA为包被抗原建立检测山羊关节炎-脑炎血清抗体的间接ELISA方法。结果表明重组蛋白rHis-CA以包涵体形式表达,具有良好的反应原性。所建立的rHis-CA间接ELISA方法的最适抗原包被质量浓度和血清稀释度分别为0.4 μg/mL和1∶100,血清阴阳性的D_(450)临界值为0.45。该方法仅与山羊关节炎-脑炎病毒阳性血清发生特异性反应,不与山羊痘病毒、蓝舌病病毒和口蹄疫病毒阳性血清发生交叉反应。对来自陕西地区的48份山羊血清进行CAEV抗体检测,rHis-CA ELISA和琼脂凝胶免疫扩散试验的阳性检出率分别为35.41%(17/48)和31.25%(15/48)。对来自天津地区2个山羊场的240份山羊血清样本进行CAEV抗体检测,rHis-CA ELISA方法和琼脂凝胶免疫扩散试验的检测结果均为阴性。