广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

猪圆环病毒2型对猪浅表淋巴组织的病理损伤及分布规律的研究

为探究猪圆环病毒2型(PCV2)在保育猪浅表淋巴组织和器官中的分布规律,帮助临床检测疾病更好地选择采样部位。对广西某地区PCV2感染的猪进行临床症状和病理学观察,结果发现感染PCV2的猪淋巴组织和器官均有不同程度的病变,其中腹股沟浅淋巴结病变较为严重。运用免疫组织化学技术进行PCV2在保育猪浅表淋巴组织分布规律的研究,发现阳性信号主要存在于巨噬细胞和淋巴细胞的胞浆中,腹股沟浅淋巴结均能检测出阳性信号,且PCV2阳性信号高于其他浅表淋巴组织。建议将腹股沟浅淋巴结作为PCV2诊断的采样组织部位。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型与沙门菌混合感染的病理学诊断

2017年1～6月,某猪场约有10%的仔猪在断奶后发生慢性消瘦和腹泻,病死率高达80%。为确诊该猪场疾病,采用病理剖检、PCR/RT-PCR检测、细菌分离鉴定、免疫组化检测、组织病理学分析等方法对病猪进行了诊断。病理剖检发现,肺小叶间质增宽,肝易碎呈棕黄色,肠系膜水肿、肠黏膜面有纤维素性坏死物附着。组织病理学表现为化脓性肺炎、桥接型肝小叶中心坏死、间质性肾炎、坏死性肠炎。从病原学方面检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)与沙门菌(Salm onella)这3种病原。综合病理学和病原学检测结果,认为沙门菌继发于PRRSV和PCV2感染,是造成该场猪群严重死亡的主要原因。     

伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型混合人工感染仔猪排毒的检测

为了解伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)感染仔猪后不同时间点的病毒载量及排毒规律,将34头健康仔猪分为4组,第1~3组分别为人工接种PRV、PCV2和PRV+PCV2组,第4组为空白对照组。分别在接种后第3、7、14、21、35天采集试验仔猪的鼻拭子和肛门拭子,用Taq Man荧光定量PCR(q PCR)对其进行定量检测,并分析仔猪排毒的变化规律。结果,接种后第3天,3个试验组仔猪肛门拭子、鼻拭子中均分离到PRV或PCV2;其中PRV单独感染后的病毒载量在第14天达到峰值331.67 copies/L;PCV2单独感染后的病毒载量在第3天达到峰值10 742.01 copies/L;PRV+PCV2混合感染后鼻拭子和肛门拭子的PRV分别在第14天和第7天达峰值980.96 copies/L和2 230.056 copies/L;鼻拭子和肛门拭子PCV2在感染后第14天达到峰值69.413 copies/L和271.72 copies/L;混合感染仔猪于感染后第8~14天发生死亡。3个感染组之间无论是肛门拭子还是鼻拭子,PRV、PCV2病毒载量均差异显著(P0.05)。上述结果表明,PRV单独感染、PCV2单独感染和二者混合感染均对仔猪造成严重危害,除引起仔猪发病死亡外,这2种病毒均能通过呼吸道和消化道向外排毒。     

人工感染仔猪猪生殖与呼吸综合征病毒的核酸分布规律

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株ATCC VR-2332保守区ORF6和ORF7的基因序列,设计了1条37 bp的寡核苷酸探针,末端用生物素标记.应用原位杂交方法对人工感染PRRSV SC-1株的28日龄仔猪进行了病毒核酸分布规律的研究.结果显示,感染后7～28 d于肝、脾、肺、肾、扁桃体、胸腺、肺门淋巴结、肠和大脑检测到阳性杂交信号,其中肺门淋巴结的阳性信号一直较强,脾的阳性信号逐渐增强,肺的阳性信号较弱,心脏未见阳性杂交信号.     

2008～2009年浙江省猪圆环病毒2型全基因组序列的比较和分析

应用PCR方法对2008～2009年采集的99份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的脾、肺、淋巴结混合组织样本进行猪圆环病毒2型(PCV2)检测,并以组织DNA为模板进行了PCV2的全基因组扩增,克隆后进行了测序。结果显示,2008年与2009年浙江省PCV2的平均阳性率为47.5%,与2004～2006年相比基本持平。随机选取18份阳性病料进行PCV2全基因组测序分析,结果,18个毒株均属于Group1,其中5个毒株(27.8%)属于1A分支,3个毒株(16.7%)属于1B分支,9个毒株(50%)属于1C分支。表明,Group1依然是浙江省PCV2的主导基因型,且1C分支从无到有,并逐渐占据主导地位。     

鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR的建立与应用

为了快速鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)的2个基因型PCV2a与PCV2b,根据PCV2a和PCV2b基因序列特征,设计PCR引物,成功建立了鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR,并进行了敏感性试验和特异性试验。结果显示,该方法对PCV2a和PCV2b的敏感性分别为9.74fg/μL和16.3fg/μL;与猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等没有交叉反应性。用该方法对采自我国华东地区的125份断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的淋巴组织样品进行检测,结果显示,单独感染PCV2a占8.0%(10/125),PCV2b占41.6%(52/125),PCV2a或PCV2b共感染占50.4%(63/125)。选取PCV2a或PCV2b单独感染的淋巴结组织病料进行病毒分离和全基因序列分析,结果分离获得4株PCV2b和1株PCV2a,与该鉴别PCR的检测结果一致,说明本研究建立的PCR可以有效鉴别PCV2a与PCV2b,具有较高的特异性和敏感性,可用于断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的临床样品中PCV2的快速检测。     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

人工感染猪流行性腹泻病毒的哺乳仔猪的病理学观察

为观察猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的哺乳仔猪的病理学变化,选取60头健康的哺乳仔猪,随机均分为A、B两组。A组仔猪经口接种PEDV细胞毒,B组作为空白对照,观察不同发病阶段A组仔猪的临床症状、剖检变化、组织切片的病理学变化。结果显示,A组仔猪潜伏期表现比较正常,仅肠道有轻微的卡他性炎症,肠道上皮细胞肿胀。前驱期仔猪出现呕吐和腹泻,肠道和淋巴结充血严重。典型症状期仔猪出现严重的腹泻、脱水、粪便恶臭等猪流行性腹泻的典型症状,严重的陆续死亡;个别组织器官出现严重病变,如肠上皮细胞脱落、肺泡融合、脾白髓萎缩、肾出现蛋白管型等。耐过仔猪生长缓慢。结果表明,A组仔猪出现典型的猪流行性腹泻的病理学变化,且病理演变过程具有一定的规律性,其致病机理可能与对肠道、肺的组织嗜性和对淋巴结、脾的免疫抑制性有关。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型猪体共感染发病模型的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV2)多以混合感染的形式,广泛存在于世界各地的猪群。本研究选取35日龄的阴性健康猪,随机分为4组:PCV2感染组(n=5)、PCV2+PRRSV共感染组(n=5)、PRRSV感染组(n=5)和空白对照组(n=4)。攻毒后每天测量体温、观察临床症状,每周称量体重并于不同时间采血,攻毒后第21天剖杀所有猪,荧光定量PCR检测血清中病毒血症和组织中病毒载量。结果表明,PCV2+PRRSV共感染组猪的临床症状最严重,并死亡2头。病理变化主要表现为肺出血、明显的间质性肺炎,淋巴组织及淋巴细胞缺失严重,淋巴滤泡中出现大量核浓缩深染的淋巴细胞;PCV2单独感染组与PRRSV单独感染组猪的临床症状轻微,仅出现短暂性体温升高;空白对照组未出现症状。病毒血症检测结果显示,两种病毒共感染组猪的血清中PCV2与PRRSV含量均高于单独感染组。本研究成功建立了PRRSV与PCV2猪体人工共感染发病模型,为PRRSV与PCV2协同致病机理研究奠定了基础。     

兔瘟病理组织学研究

作者对实验感染兔瘟病毒不同病期内病兔的心,肝、脾、肺、肾、肠系膜淋巴结、胸腺、胃、肠、脑垂体、睾丸等组织的病理形态学动态变化进行了观察。结果表明,兔瘟病毒具有组织泛嗜性;接种病毒后10小时肝、淋巴器官等就出现细胞学变化,特别是肝脏病变经历了一个典型的发展过程。     

猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响

将猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)单感染和共感染的6周龄仔猪,于感染前和感染后第3、7和10 d,采用血常规法、SWC3a单色流式细胞术以及CD3/CD4/CD8三色流式细胞术分析了感染猪外周血中白细胞、粒细胞、单核细胞、NK细胞、γδT细胞的含量。结果,感染后第3 d和第7 d,PRRSV感染组、PCV2感染组以及PRRSV+PCV2共感染组猪的白细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、γδT细胞总数显著下降,并且共感染组比单感染组下降更加严重。结果表明,PRRSV+PCV2共感染对仔猪外周血天然免疫细胞的影响具有协同效应,意味着在感染早期可导致更加严重的先天免疫抑制。     

变异猪伪狂犬病病毒自然感染仔猪的病理组织学研究

为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异株对自然感染仔猪的组织病理损伤,对自然感染发病仔猪进行病理剖检、细菌分离、病毒PCR鉴定、病毒分离培养、病毒粒子观察、基因序列分析及病理组织学观察,证实该发病仔猪为典型的PRV病毒变异株感染发病。病理剖检和病理组织学检查结果显示,发病仔猪脑、心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官组织可见典型的猪伪狂犬病剖检病变和病理组织学变化。脑实质中小血管扩张充血,大量胶质细胞浸润,形成明显的血管套和噬神经元现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;全身免疫器官淋巴细胞减少等。同时发现PRV在发病仔猪全身分布广泛,且组织中病原含量与组织病理损伤程度密切相关。结果表明,自然发病仔猪感染的PRV变异毒株属于强毒株,具有较强的致病性。     

β-防御素caBD-1 mRNA在骆驼组织器官中的表达

根据已知的骆驼 β 防御素caBD 1cDNA序列设计了 1对预计扩增产物为 2 0 3bp的引物 ,通过RT PCR检测骆驼的整个消化道黏膜、肝、胰腺、气管黏膜、肺、肾、膀胱黏膜、卵巢、子宫内膜、脾、淋巴结、心等器官内caBD 1mRNA的表达。结果显示 :caBD 1mRNA在整个消化道、气管、膀胱、子宫等管状器官内的黏膜层有表达 ,而在实质性器官如心、肝、胰腺、肺、脾、淋巴结、卵巢、肾中无表达。提示 ,骆驼体内的这种内生性抗微生物肽有助于骆驼的黏膜宿主防御     

猪腺病毒3型SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对猪腺病毒3型(PADV3)的检测方法,根据PADV3E1B基因保守序列设计1对引物,建立了检测PADV3的SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR。结果显示,该方法不能对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌、猪链球菌2型检测到荧光信号,特异性好;检测PADV3时在3.7×102~3.7×109 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,熔解温度为90.5℃;该方法组内变异系数为0.17%~1.23%,组间变异系数为0.73%~2.23%,重复性较好。应用该方法对临床56份腹泻粪便检测,检出11份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。上述结果表明,建立的实时荧光定量PCR为PADV3感染的早期诊断、流行病学调查奠定了技术基础。     

SABC法对伪狂犬病病毒鄂A株在仔猪体内的定位

运用免疫组织化学SABC法对人工感染伪狂犬病病毒的仔猪部分组织进行组织学观察。结果显示,在肺、大脑、小脑、脊髓、脊神经节、淋巴结、扁桃体、胸腺、脾、肝、肾、肾上腺、胃、肠等组织内均发现阳性细胞,尤其在肺、神经组织和淋巴组织内为多,病毒主要侵害上皮细胞、神经细胞和淋巴细胞,主要存在于被感染细胞的胞浆和胞核内,但以胞浆内为主。     

广西断奶仔猪猪圆环病毒2型的检测

对广西 16个养猪场的 2 2份断奶仔猪病料用PCR技术检测猪圆环病毒 2型 (PCV 2 ) ,对阳性病料进一步检测猪瘟病毒、猪生殖和呼吸系统综合征病毒、伪狂犬病病毒及细菌性病原。结果 ,从南宁市郊某猪场表现衰弱症状的病猪病料中检测出PCV 2 ,而这些病料没有检出猪瘟病毒、猪生殖和呼吸系统综合征病毒、伪狂犬病病毒及可疑细菌 ,证实广西存在PCV 2引起的断奶仔猪多系统衰弱综合征 (PMWS)。     

雏鸡体内新城疫病毒强毒的荧光定量RT-PCR检测

将新城疫病毒(NDV)强毒H2株经滴鼻感染和同居感染18日龄雏鸡,应用建立的荧光定量RT-PCR检测病毒在雏鸡体内各组织的动态分布.结果显示,滴鼻感染后第6 h,即可在肺、脑、脾、肾和肠5种组织中检出NDV RNA,而12 h后所有组织均能检测到;同居感染12 h后才可在肺、脑、脾和肾4种组织中检出,而24 h后所有组织均能检测到;在上述2种感染途径中,受检组织内的病毒含量从高到低依次为:肺、脑、脾、肾、肠、肝、心脏和腿肌.与普通RT-PCR相比,检测灵敏度相近.