鸭瘟病毒CY07株诱导的细胞凋亡及凋亡对其增殖的影响

通过荧光染色对鸭瘟病毒(DPV)CY07株诱导的细胞凋亡进行了测定,并通过real-time PCR测定了其在鸭胚成纤维细胞上的增殖规律,探讨了DPV CY07诱导鸭瘟发生的机制.结果显示,DPV CY07株诱导鸭胚成纤维细胞凋亡的凋亡率于接毒后第12 h时达到峰值12.85%,对照毒株鸭瘟标准毒诱导的细胞凋亡在接毒后第8 h达到峰值10.57%.DPV CY07株的数量在接毒后第20 h开始急剧增加,至第24 h增幅为102.02;鸭瘟标准毒的数量在接毒后第16 h开始急剧增加,至第24 h增幅为102.21,且试验结束时DPV CY07株的病毒量低于鸭瘟标准毒株.说明,DPV CY07株诱导细胞凋亡的能力较强,这可能是其毒力强的主要原因.     

A型禽流感病毒NS1蛋白的表达及其诱导细胞凋亡功能的研究

利用瞬时表达方法表达禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,并初步研究了体外表达的NS1蛋白对宿主细胞凋亡的影响.应用脂质体介导法,将含有不同亚型AIV NS1基因的阳性质粒pcDNA3.1(+)-qNS1(H5N1)、pcDNA3.1(+)-rNS1(H9N2)转染Vero细胞系及MDCK细胞系.经SDS-PAGE及Western-blotting检测,qNS1和rNS1基因在Vero细胞及MDCK细胞中均获得了表达.应用AO/EB荧光染色法、Annexin V-PI法分别对转染后的Vero细胞及MDCK细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,转染阳性质粒的MDCK细胞凋亡率增高,而转染空载体pcDNA3.1(+)的MDCK细胞及转染的Vero细胞均无明显变化.表明,qNS1、rNS1蛋白在体外培养的MDCK细胞中表达并能够诱导其发生凋亡,而在Vero细胞中却不能发挥此功能.     

口蹄疫病毒VP1蛋白诱导犊牛甲状腺初代细胞凋亡的鉴定

为了制备和培养犊牛甲状腺初代细胞(CTY),并检测口蹄疫病毒VP1蛋白对其诱导的凋亡情况,采用原代细胞培养方法,取初生犊牛甲状腺制备初代细胞并培养。采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,再用限制性内切酶EcoRⅠ+XhoⅠ酶切后定向克隆到表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-VP1,转染CTY,用Western-blot检测口蹄疫病毒VP1蛋白在犊牛甲状腺初代细胞中的表达情况;通过显微镜观察转染的CTY细胞状态、经AV-PI双染色、检测线粒体膜电位变化和Hoechst-33258荧光染色来检测细胞凋亡。结果显示,成功制备了犊牛甲状腺初代细胞,构建的重组质粒可以在犊牛甲状腺初代细胞中表达,通过几种方法均证明口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导犊牛甲状腺初代细胞的凋亡,细胞凋亡率比空载体对照组高约2倍。结果表明,口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导CTY的凋亡,这一结果为深入研究口蹄疫病毒VP1蛋白凋亡功能域和VP1诱导的凋亡途径奠定了基础。     

口疮病毒ORFV125蛋白抑制宿主细胞凋亡的研究

分析显示,口疮病毒(ORFV)125蛋白的3D结构及其结构域与Bcl-2家族蛋白高度相似。为了探索ORFV125蛋白是否具有Bcl-2蛋白的抑制细胞凋亡作用,本研究通过构建ORFV125基因单个结构域突变体质粒BH1、BH2、BH3、BH4和缺失BH1、BH2、BH3、BH4结构域的突变体质粒,分别将不同质粒分别转染到293T细胞后培养24 h和72 h时通过流式细胞仪检测对细胞凋亡的作用。结果,在转染质粒的细胞培养到第24小时的细胞早期凋亡率低于5%,细胞晚期凋亡率低于6%;在转染质粒的细胞培养到第72小时的细胞早期凋亡率高于20%,细胞晚期凋亡率低于4%;而在同一时间点比较,各个的突变体之间的凋亡效果没有显著性差异。以上结果表明,ORFV125蛋白及其突变体具有抑制凋亡的作用,但随着凋亡时间的持续凋亡效果更加明显,这为进一步开展ORFV125蛋白的研究提供了实验基础。     

大鲵蛙病毒US22家族基因的TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了进行大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)的早期诊断,以US22家族基因作为靶基因,建立大鲵蛙病毒Taq Man MGB实时荧光定量PCR检测方法,同时对该方法进行特异性、敏感性、重复性评估,并对73份未知大鲵血液样品进行检测。结果显示,标准曲线在所选浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.997;该方法对大鲵蛙病毒的检测有高度特异性,与其他8种病毒或细菌之间均无交叉反应;灵敏性良好,能检测到2.00×101copies/L的标准品浓度,比普通PCR高1 000倍;批内和批间重复的变异系数均小于2%,重复性好;在73份未知样品检测中,Taq Man MGB实时荧光定量PCR能够检测到更低浓度的病毒,较常规PCR的敏感性更佳。鉴于该方法快速、特异、敏感、可重复、可定量的优点,对大鲵蛙病毒早期潜伏感染的快速诊断具有重要意义。     

鸭坦布苏病毒诱导细胞自噬并促进病毒复制的初步研究

细胞自噬在不同病原体感染过程中有着不同的作用,目前尚未见鸭坦布苏病毒(DTMUV)与细胞自噬之间相互作用的报道。本研究通过激光共聚焦方法观察标记LC3自噬荧光颗粒,以及蛋白免疫印迹检测LC3-I/LC3-Ⅱ转化和P62降解,确定鸭坦布苏病毒能促进BHK21细胞自噬。自噬药物调节剂(雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤)试验结果表明,细胞自噬有利于DTMUV在BHK21细胞中的复制。表明DTMUV感染BHK21细胞能诱导细胞发生自噬,同时细胞自噬又能促进DTMUV复制。     

氟苯尼考诱导氧化应激和细胞凋亡引起的肉鸡肾损伤

为了探究氟苯尼考对肉鸡肾的损伤作用及其可能机制,将180只肉鸡随机分为空白对照组和不同剂量的氟苯尼考组(0.15,0.3,0.6,1.2和1.8 g/L)。从1日龄开始,连续饮水给药5 d。于试验第42天,翅下静脉收集血液并尽快摘取完整的鸡肾。记录和分析各组肉鸡的平均增重和肾指数;用HE染色法观测肉鸡肾组织病理学变化;检测肉鸡血清中肾功能指标尿酸(UA)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)的含量以及肾组织中过氧化指标丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的水平;采用Western-blot法检测肾组织中p53,Caspase-3和Caspase-6的蛋白表达水平。结果显示,与空白对照组相比,较高剂量的氟苯尼考均能显著降低肉鸡的平均增重(P0.01)和升高肾指数(P0.05或P0.01)。各剂量氟苯尼考组中的肾组织细胞均显示出明显的损伤、变形、细胞萎缩和细胞间隙增大的现象。此外,所有剂量氟苯尼考均显著提高了试验肉鸡血清中BUN含量(P0.05或P0.01),1.8 g/L氟苯尼考显著提高了UA和CRE含量(P0.05或P0.01),1.2 g/L氟苯尼考组UA含量也显著升高(P0.05)。所有剂量的氟苯尼考均能显著提高试验肉鸡肾组织中MDA含量(P0.01)却显著降低了CAT的水平(P0.05或P0.01);除0.15 g/L氟苯尼考组外(P0.05),其余剂量的氟苯尼考组GSH和SOD水平均显著降低(P0.01)。除0.3 g/L氟苯尼考组外(P0.05),其余剂量氟苯尼考组试验肉鸡肾组织中Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P0.01)。结果提示,1日龄给予氟苯尼考对肉鸡具有显著的肾毒性,这种毒害作用会持续到肉鸡出栏,并且具有剂量依赖性。这种损伤可能与氟苯尼考促进肉鸡肾内氧化应激反应,上调促凋亡因子的表达有关。     

口蹄疫病毒亚单位与宿主细胞凋亡的研究进展

通过对口蹄疫病毒和其他小RNA病毒的蛋白质功能研究进行总结,分析了口蹄疫病毒蛋白参与调控宿主细胞凋亡平衡的作用,并对口蹄疫病毒持续感染形成的机制进行了探讨.     

蛙病毒感染致养殖大鲵大规模死亡的电镜观察及PCR检测

为探索2009年12月甘肃陇南与陕西汉中养殖的大鲵发生的以皮肤出现白点、出血斑、溃疡,四肢肿胀,溃烂和头部肿胀为特征并引起大规模死亡疾病的原因,采用针对蛙病毒的特异性PCR方法与电子显微镜观察对患病大鲵进行了蛙病毒感染的诊断。结果显示,在病鲵的肝、脾和肾中发现大量直径为140～180nm的虹彩病毒样颗粒;针对蛙病毒的特异性PCR扩增出蛙病毒衣壳蛋白基因500bp的目的片段,测序后经采用BLAST软件分析,发现其与GenBank中的蛙病毒衣壳蛋白基因同源性达96%～99%。确认本次养殖大鲵发生大规模死亡是蛙病毒感染所致,首次报道了蛙病毒感染对我国养殖大鲵的危害。     

山羊痘病毒SERPIN蛋白抑制宿主细胞凋亡活性的鉴定

采用PCR扩增长为1 041bp的山羊痘病毒(GTPV)serpin基因,构建真核表达质粒pcDNA-Ser-pin;将其转染HeLa细胞,经G418筛选,克隆纯化、鉴定,获得1株稳定表达GTPV SERPIN蛋白的HeLa细胞株;然后通过检测凋亡诱导剂TNF-α和放线菌酮作用后的细胞形态学变化、细胞活力和caspase活性,对GTPV SERPIN蛋白抑制宿主细胞凋亡的活性进行了鉴定。序列分析结果表明,GTPV SERPIN与正痘病毒SPI-1和SPI-2的氨基酸序列同源性为36%～38%;与痘苗病毒SPI-2空间构型相近,VADC基序和P1氨基酸(天门冬氨酸)相同。细胞试验结果显示,GTPV SERPIN蛋白能抑制由TNF-α和放线菌酮诱导的细胞凋亡,抑制率达70%左右,且这种抑制作用与其下调细胞caspase-8活性有关。证实GTPV SERPIN能抑制宿主细胞凋亡,可能是GTPV的致病因子之一。     

依达拉奉在庆大霉素诱导MDCK细胞凋亡中的保护作用

为研究依达拉奉(edaravone,EDa)在庆大霉素(gentamicin,GM)诱导MDCK细胞凋亡中的保护作用,本研究用4 mmol/L GM和40?mol/L EDa单独或联合处理MDCK细胞24 h,Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率;Hochest 33258染色观察细胞核形态变化;比色法检测总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量;荧光染色检测活性氧(ROS)含量;Western-blot检测Bax与Bcl-2表达量,caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化情况,细胞色素C(Cyt C)和凋亡诱导因子(AIF)释放情况。结果显示,与对照组相比,EDa组无显著性影响。与GM组相比,GM+EDa组细胞凋亡率显著或极显著性下降(P0.05或P0.01);T-SOD和GSH-PX活力显著性下降(P0.05);CAT活力极显著性上升(P0.01);MDA含量极显著性下降(P0.01);ROS含量显著性下降(P0.05);Bcl-2/Bax比值显著性升高(P0.05);caspase-9、caspase-3和PARP蛋白的活化水平显著或极显著性降低(P0.05或P0.01);Cyt C与AIF含量显著性降低(P0.05)。结果表明,依达拉奉在庆大霉素通过线粒体凋亡途径诱导MDCK细胞凋亡中起保护作用。     

番鸭呼肠孤病毒诱导免疫抑制机制的初步研究

以5日龄健康番鸭为研究对象,人工感染番鸭呼肠孤病毒(MDRV),采用组织化学和免疫学技术检测外周血淋巴细胞转化率,T淋巴细胞ANAE阳性率,IL-2和IL-6含量,脾和腔上囊中浆细胞数量的变化.结果显示,MDRV感染组番鸭外周血淋巴细胞转化率和T淋巴细胞ANAE阳性率均极显著低于对照组(P<0.01),腔上囊和脾中浆细胞数量在攻毒后第10～20 d显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01),血清中IL-2和IL-6含量在攻毒后第10 d均极显著低于对照组(P<0.01).结果表明,MDRV感染能较快且持久地降低机体细胞的免疫功能,破坏免疫器官中的浆细胞,影响体液免疫功能,还影响免疫分子IL-2和IL-6的形成,进一步干扰机体免疫功能的发挥,从而容易诱发继发感染,增加死亡率.     

细胞凋亡检测技术的研究进展

细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式 ,是在一定的生理或病理情况下 ,机体为维护内环境的稳定 ,通过基因调控 ,激活内源性核酸内切酶而发生的细胞自动消亡的过程 ,亦称为程序化细胞死亡 (programmedcelldeath ,PCD) [1 ] 。自 1 972年Kerr等[2 ] 根据细胞发生了与坏死完全不一样的死亡过程而提出细胞凋亡 (apoptosis)的概念后 ,引起细胞生物工作者的注意 ,但由于当时检测技术的限制 ,这种细胞凋亡现象只停留于形态描述 ,缺乏定性、定量、定位的依据 ,并未引起病理工作者的重视。 2 0世纪 80年代末 ,随着分子生物学、细胞生物学等…     

chTERT mRNA表达及端粒酶活性在氯化镧诱导MDCC-MSB1细胞凋亡中的作用

为探讨chTERT mRNA表达及端粒酶活性在LaCl3诱导MDCC-MSB1细胞凋亡中的作用.将肿瘤细胞常规培养于RPMI 1640培养液中,加入终浓度为3 mmol/L的LaCl3共培养,分别于培养第12、24、36和48 h,用透射电镜观察LaCl3致MDCC-MSB1细胞的形态学变化,应用流式细胞仪检测细胞凋亡,以TRAP-PCR银染法检测端粒酶活性,以实时荧光定量PCR法检测chTERT基因mRNA的表达量变化.结果显示,3 mmol/L的LaCl3作用第12、24、36和48 h,透射电镜和流式细胞仪法均检测到明显的细胞凋亡变化,端粒酶活性下降,chTERT mRNA的表达量下降,并呈时间一效应关系.证实,LaCl3可通过降低chTERT mRNA的表达量抑制MDCC-MSBl细胞的端粒酶活性而诱导其发生凋亡.     

新城疫病毒通过巨胞饮作用入侵HeLa细胞的研究

新城疫病毒(NDV)在体外可以感染多种细胞,但是感染机制尚未完全明确。本试验针对NDV通过巨胞饮途径感染He La细胞的过程进行研究,选择特异性针对巨胞饮作用的药物抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利(EIPA)、肌动蛋白(actin)聚合作用抑制剂细胞松弛素D(Cyto D)、PK C激酶抑制剂卡马拉素(Rottlerin)等,分别作用于He La细胞,通过W estern-blot和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测NDV感染He La细胞的情况。结果显示,在病毒感染后第3、6小时,EIPA能显著抑制NDV的进入,并且存在药物剂量的依赖性,同时,Cyto D和Rottlerin在第3、6和12小时也能显著抑制NDV的进入。结果表明,巨胞饮作用可能是NDV侵入细胞的一种重要途径,该结果将有助于进一步解析NDV的感染方式。     

猪水泡病病毒与口蹄疫病毒引起寄主细胞(组织培养的肾细胞)病理过程的超微结构研究

据报导,近年在意大利和英国流行的一种新的猪水泡病病原体,认为是一种属于肠道类的病毒。对提纯病毒的电子显微镜观察说明,是直径为30～32毫微米的球状病毒(1、2)。我们用超薄切片技术,对国内某地流行的猪水泡病病毒在寄主细胞内的分布,晶格排列与形态也进行了电子显微镜观察,是直径为22～23毫微米的近似球形的病毒(3)。在前一阶段工作的基础上,我们继续研究了猪水泡病病毒引起寄主细胞(组织培养的肾上皮细胞)病理过     

黄牛上皮乳头瘤的诊断及几种治疗法的比较

牛皮肤乳头瘤是由牛乳头状病毒(BPV)属乳多空病毒群引起的以多发性皮肤疣为特征的慢性增生性传染病。欧洲、美洲和亚洲的许多国家均报告有此病发生。1984年5月、笔者在四川大邑县发现两黄牛全身密布疣样赘生物,经临床、病理学检查、确诊为皮肤乳头瘤病,并给予了不同方法的治疗,现报告于后。     

猪链球菌2型39ku胞壁蛋白诱导巨噬细胞凋亡的研究

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)的39ku胞壁蛋白对巨噬细胞的致病作用,将39ku胞壁蛋白纯化,取小鼠腹腔巨噬细胞(murine peritoneal macrophage,MPM)和39ku胞壁蛋白(4μg/mL和40μg/mL)共孵育,用荧光显微镜观察细胞的形态学变化,以不同浓度(4～50μg/mL)39ku胞壁蛋白腹腔注射小鼠,作用6h,用DNA Ladder法检测MPM凋亡情况,以40μg/mL腹腔注射,分别作用2、4、6、8h,用流式细胞术检测MPM凋亡率,同时用试剂盒比色法检测其Caspase 3的表达动态。结果显示,低浓度(4μg/mL)诱导后MPM未见异常形态改变;而高浓度(40μg/mL)能引起典型的凋亡形态学变化,低浓度(4μg/mL)诱导后,DNA图谱与阴性对照相同;而高浓度(20～50μg/mL)诱导后均出现典型的DNALadder,且随39ku胞壁蛋白浓度增加,梯状条带更加清晰。流式细胞分析表明,MPM的凋亡率随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而增加,与对照组之间均差异极显著(P<0.01);Caspase 3的表达量随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而上升,各时间点之间均差异显著(P<0.05)。结果表明,39ku胞壁蛋白可以诱导MPM高水平凋亡,凋亡率与39ku胞壁蛋白的作用浓度和时间之间正相关,39ku胞壁蛋白可单独作为SS2的毒力因子。     

Fas与卵巢卵泡细胞凋亡的研究进展

细胞凋亡 (ａｐｏｐｔｏｓｉｓ)是生物机体维持自身稳定的一种基本生理机制 ,是机体生长、分化、发育以及病理过程中由基因编码的细胞主动自杀过程。细胞凋亡的研究是目前世界范围内生物学和医学领域的研究热点之一 ,了解细胞凋亡的发生和调控将有助于解释许多生物现象和疾病病因。因此 ,近年来以细胞凋亡学说理论为导航 ,生命科学领域的研究都集中到生命信息这一点 ,并已取得了惊人的进展。目前 ,细胞凋亡的研究已涉及人、多种动物和禽类 ,扩展到许多学科领域。众所周知 ,在雌性哺乳动物的卵巢发育中 ,绝大多数卵泡 (人、大鼠、犬 >99.9% )…     

鹅胸腺细胞自然凋亡的电镜观察

应用透射电镜观察表明,鹅胸腺细胞发生凋亡时,细胞经历一系列的形态变化.其中,细胞核的变化最为明显,表现为染色质凝集、边集,呈现为新月形、C字形、花瓣状、圆环状或圆斑状.部分凋亡胸腺细胞可见线粒体轻度增生现象.至凋亡后期,胸腺细胞由其膜性结构分隔、包裹形成凋亡小体;最后,凋亡小体或凋亡细胞被巨噬细胞吞噬、清除.