大熊猫IgG Fc HRP酶标二抗的制备

为获得辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗大熊猫Ig G抗体,本研究利用重组大肠杆菌表达技术对大熊猫Ig G Fc片段进行了表达,获得重组蛋白后进行了小鼠免疫,抗体特异性检测,并进行了多克隆抗体的HRP标记。结果显示,在37℃、IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导5 h的条件下,可获得分子质量约为88 ku的目的蛋白;将重组蛋白免疫小鼠后,免疫小鼠血清与重组蛋白反应效价可达1∶102400以上,且与大熊猫血清Ig G反应良好,经HRP标记试剂盒标记的鼠抗大熊猫Ig G效价可达1∶25600以上。上述结果表明,本研究成功制备了HRP标记的小鼠抗大熊猫Ig G二抗,为大熊猫疾病血清学检测方法的开发提供了支撑。     

表达副鸡禽杆菌外膜蛋白的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性研究

为构建表达副鸡禽杆菌外膜蛋白的重组乳酸乳球菌,本试验按照乳酸乳球菌表达的偏好性,优化合成副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的编码碱基序列,将其接入表达载体pNZ8149的多克隆位点并导入食品级乳酸乳球菌NZ3900。将重组乳酸乳球菌灭活后经肌肉注射免疫SPF鸡,免疫后攻毒测定乳酸乳球菌的保护效果,检测血清中Ig G抗体和鼻黏膜sIgA抗体水平并检验免疫效果。PCR结果显示,成功构建了含p9片段的重组乳酸乳球菌,Western-blot检测显示,p9片段可在重组乳酸乳球菌内表达。重组菌最佳诱导表达条件:Nisin浓度为20 ng/m L、诱导时间为4 h。鸡肌肉注射免疫后可产生p9蛋白特异性的血清Ig G和鼻黏膜sIgA抗体。乳酸乳球菌重组疫苗免疫鸡对副鸡禽杆菌攻毒的保护率为60%~80%。结果表明,本研究成功构建了重组乳酸乳球菌pNZ8149-p9/NZ3900,该重组菌作为免疫原免疫鸡,对副鸡禽杆菌攻毒具有较好的免疫保护作用。     

两种旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对小鼠免疫保护效果的评估

为评估旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对BALB/c小鼠的免疫保护作用,选用2种重组表达的Serpin型和Kazal型旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsAdSPI和TsKaSPI）,联合弗氏佐剂通过腹腔注射的方式单独免疫小鼠,用间接ELISA法检测免疫后小鼠特异性血清抗体Ig G以及Ig G亚型（IgG1和Ig G2a）的水平,用CCK-8法测定重组蛋白刺激后脾淋巴细胞的增殖情况,用ELISA法检测脾淋巴细胞培养液上清中细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-12和IL-4的水平;使用旋毛虫肌幼虫攻击感染免疫后的小鼠,计算并分析小鼠肠道成虫减虫率及肠道病理变化,并评估TsAdSPI和TsKaSPI与ISA206佐剂联合免疫小鼠后对小鼠肠道成虫减虫率的影响。结果表明,与PBS组相比,2种重组蛋白所诱导的Ig G和Ig G亚型抗体水平均明显升高,IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10表达水平也均显著升高,且重组蛋白可诱导免疫小鼠脾淋巴细胞的体外增殖;攻虫结果表明,2种重组蛋白免疫后小鼠肠道旋毛虫成虫数量较PBS组显著减少且肠道病理变化减轻;2种重组蛋白联合免疫组的成虫减虫率高于单独免疫组。上述结果...     

表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性的研究

为探究表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌口服免疫动物诱导的特异性免疫应答,本研究构建了p MG36e-SLN重组质粒并将其电转化至乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中,制备表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌,经SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定目的基因表达,并将重组菌口服免疫新西兰大白兔,利用间接ELISA方法测定家兔小肠黏膜和血清中抗SLN蛋白特异性Ig G和Ig A。结果显示,表达重组SLN蛋白的重组菌经口服能够有效引起动物体产生较高水平抗SLN蛋白Ig G和一定量的抗SLN蛋白Ig A,表明该重组菌表达系统能刺激动物免疫系统产生应答,具有作为口服疫苗的潜在应用价值。     

鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的表达纯化及其生物学特性的研究

为研究鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC的生物学特性,利用PCR方法扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC基因,构建重组表达质粒p ET-32a-FliC,经大肠杆菌Rosetta(DE3)表达、镍离子亲和层析法纯化后用SDS-PAGE和Western-blot方法分析。重组蛋白与巨噬细胞RAW264.7共孵育,ELISA和CCK-8法分别检测巨噬细胞细胞因子和巨噬细胞增殖情况。重组蛋白免疫小鼠后不同时间点检测血清抗体效价和细胞因子水平。结果显示,鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC在大肠杆菌中呈可溶性表达,且可获得纯度较高的重组鞭毛蛋白。50 ng/m L和500 ng/m L重组鞭毛蛋白可刺激巨噬细胞增殖,同时促进巨噬细胞分泌IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α。重组蛋白免疫小鼠后效价在第3周达到1∶128 000,同时小鼠血清细胞因子的分泌量呈倒V型变化。研究结果为后续进一步研究FliC蛋白在细菌感染、侵袭和免疫方面的作用研究提供了参考数据。     

旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白诊断特性的鉴定

为鉴定旋毛虫肠道期肌幼虫cystatin-like基因重组蛋白的诊断特性,利用ELISA方法,以旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白作为包被抗原,并以旋毛虫感染早期肠道6 h幼虫ES抗原作为阳性对照,用不同旋毛虫感染剂量、不同感染时间小鼠血清为一抗,检测血清中抗旋毛虫Ig G抗体的变化情况,利用Excel软件绘制出Ig G抗体消长规律曲线并进行数据分析,鉴定该基因重组蛋白作为诊断抗原时的敏感性及诊断效果。结果显示,在低剂量感染和高剂量感染时,该基因重组抗原分别从感染后第10天和第8天起可以稳定地检测出抗旋毛虫Ig G抗体;在感染后第11天至第45天一直呈"波峰波谷"式并维持较高水平;感染早期(第15~45天)低剂量感染组的Ig G抗体水平明显高于高剂量组。由此推断,旋毛虫cystatin-like基因重组蛋白具有很好的早期诊断特性,尤其对低剂量早期感染的诊断效果更佳,并推测该基因极有可能在旋毛虫感染早期对宿主的免疫抑制作用中起重要作用,其具体应用前景和生物学功能还有待于进一步研究。     

鸭源鸡杆菌外膜蛋白A的原核表达及免疫保护性分析

为评价鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)外膜蛋白A(Outer membrane proteins A,OmpA)的免疫原性及免疫保护力,本研究通过PCR技术扩增去除信号肽的ompA基因序列,酶切后与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a(+)-OmpA,在IPTG诱导下成功表达出约40 ku的包涵体蛋白。Western-blot分析显示重组蛋白rOmpA具有抗原性;以纯化的rOmpA免疫小鼠,分别在一免后第2周和第4周进行加强免疫。三免后进行抗体检测并以G.anatis PDS-RZ-1-SLG株的5×LD_(50)攻毒,同时设立全菌灭活组和PBS组作为对照。结果显示,rOmpA可诱导小鼠产生较高水平的抗体,可提供50%的免疫保护力。结果表明,鸭源鸡杆菌外膜蛋白A是一种保守性共同抗原,可作为鸭源鸡杆菌疫苗的候选抗原。     

携带Apoptin的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统的构建

为研究减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统介导Apoptin的特性,将Apoptin基因克隆入载体pYA3493-SopE,构建重组载体pYA3493-SopE-Apoptin,然后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,对该重组菌生长特性、生化特性、毒力和表达等特性进行分析;同时将重组菌体外感染B16F10黑色素瘤细胞,分析其介导Apoptin对B16F10的作用。PCR、酶切检测表明,携带Apoptin的重组减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-SopE-Apoptin)构建成功;生物学特性分析发现,重组菌的生长特性、生化特性与缺失株ΔcrpΔasd SL1344和互补株ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-SopE)相近,与亲本株SL1344差异明显;腹腔感染重组菌的C57BL/6小鼠的LD_(50)为1.69×10~7CFU;在重组菌培养上清和感染的B16F10细胞内均可检测到SopE-Apoptin蛋白条带。进一步研究其介导Apoptin对B16F10细胞的作用发现,重组菌可抑制该细胞增殖,且具有MOI浓度梯度和感染时间依赖性;用TUNEL法可观察到TUNEL阳性细胞;Western-blot可在重组菌感染的细胞内检测到Caspase-9凋亡信号蛋白表达。以上结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统能够介导Apoptin蛋白的分泌性表达,且能够诱导肿瘤细胞B16F10的凋亡。     

停乳链球菌GapC的免疫特性分析及B细胞抗原表位的筛选与鉴定

旨在表达牛乳源停乳链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GapC）,预测并鉴定其B细胞抗原表位。本研究采用PCR扩增停乳链球菌GapC基因,构建重组质粒p ET-28a-TR-X16087-2。经IPTG诱导表达后纯化GapC蛋白,并以纯化的GapC蛋白免疫小鼠,采用ELISA方法检测Ig G抗体效价及抗体分型,分析对小鼠的免疫保护效力。结果显示,成功表达了大小为44 ku的GapC蛋白,对小鼠的免疫保护率为76%。预测并筛选出3个B细胞抗原表位,鉴定了1个优势抗原表位BP3:196PHRGGDLRRARAGAAN206。上述结果表明,本研究成功表达了停乳链球菌GapC蛋白,对其免疫效果进行了评估,预测与鉴定了其B细胞表位,为GapC蛋白功能和表位疫苗的研究奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株分泌性蛋白K1缺失株的构建及其生物学特性的初步研究

为研制更加安全有效且遗传背景清晰的鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)疫苗弱毒株,本研究首先构建了含缺失1 011 bp sseK1基因的重组自杀性质粒PREΔsseK1,利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的sseK1缺失株。PCR、双酶切及测序结果表明SL1344ΔsseK1构建成功。生物学特性初步研究表明,与亲本菌株SL1344相比,缺失株SL1344ΔsseK1保留了亲本株SL1344的血清型1,4,5,12∶i∶1,2,且能够稳定遗传缺失后的sseK1基因,生长速度及生化特性没有发生明显改变。小鼠毒力试验表明,SL1344ΔsseK1缺失株口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD_(50)为6.63×10~8CFU,毒力较亲本株SL1344下降至0.048%。免疫保护效力试验显示,小鼠免疫后第14天血清抗体Ig G含量达到最高,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率。以上研究结果表明,SL1344株sseK1基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为研究sseK1基因的致病机制及将其开发为更加安全有效的沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定了基础。     

表达IBDV VP2蛋白的重组弱毒肠炎沙门菌的构建及其免疫原性的初步研究

为研究肠炎沙门菌rfaH基因与致病性的关系及肠炎沙门菌rfaH基因缺失株作为疫苗载体的可行性,进一步探索传染性法氏囊病(IBD)的防控路径,通过λ-Red同源重组的方法构建了缺失rfaH基因的肠炎沙门菌(rSD),再以其为亲本菌株构建了稳定表达IBDV VP2蛋白的重组肠炎沙门菌(Se-VP2)。以1日龄SPF雏鸡为实验动物,分别检测了重组菌的致病力及免疫效果。结果显示,rSD株和Se-VP2株与野生株生长速度一致,体外连续传20代,基因缺失株和重组株均可稳定遗传;Western-blot表明,Se-VP2株可稳定表达VP2蛋白;构建的重组菌rSD株和Se-VP2株对SPF雏鸡无致病性,半数致死量(LD50)大于1.0×1010CFU,且重组菌Se-VP2株免疫动物后可同时诱导产生针对IBDV和沙门菌的抗体;重组菌Se-VP2株可以诱导T淋巴细胞产生Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4,并能刺激外周血淋巴细胞的增殖分化;攻毒保护性试验结果显示,Se-VP2株免疫动物后可对IBDV和沙门菌的感染提供100%的保护。结果表明,rfaH基因是沙门菌的毒力基因,重组弱毒肠炎沙门菌Se-VP2株作为疫苗候选株,对SPF雏鸡安全有效,为后续肠炎沙门菌作为表达载体的研究奠定了基础。     

表达禽流感病毒HA2-DEC205的减毒沙门菌DNA疫苗载体的构建与初步研究

构建表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型重组减毒沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-sec)和χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec),将其免疫小鼠,通过流式细胞术检测免疫细胞的变化。结果表明,沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec)能够提高CD3+CD4+T细胞分泌细胞因子IL-4、IFN-γ的水平。这说明重组沙门菌免疫小鼠能够激活机体的免疫系统,诱导发生一定的免疫反应。     

日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶基因的表达及其免疫保护试验

为研究日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶(SjPP)的免疫功能,构建了原核表达重组质粒pET28a( )-SjPP,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)进行诱导表达,并用重组蛋白进行了小鼠免疫保护试验,免疫剂量为每次20μg/只,共免疫3次。结果表明,pET28a( )-SjPP/BL21(DE3)在0.1 mmol/L IPTG诱导2 h时,每1 g菌体可产生17.8 mg以包涵体形式存在的重组蛋白;重组蛋白免疫小鼠后诱导产生了高效价的血清特异性IgG抗体,并获得了部分减虫率、肝组织减卵率和显著的粪便减卵率,具有一定的免疫保护作用。     

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。     

表达破伤风毒素C片段的重组鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定

为构建表达破伤风毒素C片段基因的减毒鼠伤寒沙门菌,将编码破伤风毒素C片段的基因插入到asd 的组成型表达载体pYA3333,转化asd基因突变的E.coliX6212,获得重组质粒pYA3333-TetC,再将重组质粒通过电穿孔法转入宿主菌,构建成表达破伤风毒素C片段基因的平衡致死的鼠伤寒沙门菌X4550(pYA3333-TetC)。免疫印迹试验证实,该重组菌表达的蛋白与预期的目的蛋白一致。重组菌X4550(pYA3333-TetC)的稳定性试验表明,在体外培养100代后,随机挑选的重组菌落全部都能生长,重组菌X4550(pYA3333-TetC)的生长曲线测定表明,X4550(pYA3333-TetC)和X4550(pYA3333)的生长状态基本一致。动物试验证明,该重组菌是安全的,破伤风毒素攻击后能提供良好的保护作用。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

将合成的非洲猪瘟病毒K205R基因序列插入p ET-28a(+)表达载体,经IPTG诱导表达p ET-28aK205R重组蛋白。用制备的重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用化学融合方法融合、筛选,获得了6A4、7F5和7G3三株抗K205R蛋白的杂交瘤细胞株。经鉴定,这3株单克隆抗体(单抗)的亚类均为Ig G1型;单抗的腹水效价分别为1∶51 200、1∶409 600和1∶102 400。将这3株杂交瘤细胞连续培养20代,在第20代仍有很高的分泌抗体的能力,表明其稳定性较好。Western-blot检测结果表明,这3株单抗与K205R重组蛋白有良好的反应性和特异性。上述结果表明,本研究制备的这3株杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗体,分泌的抗体特异性高,为非洲猪瘟诊断技术的研究奠定了基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表达及其表达产物的抗原性

为了确定猪生殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白A、B抗原表位之间的相互关系和对免疫的影响,应用PCR方法扩增出A、B抗原表位基因并分别克隆于原核和真核表达载体中。原核重组质粒表达的重组蛋白经Western-blotting检测证明,该重组蛋白具有良好的抗原性。将重组蛋白和真核表达质粒免疫小鼠,前者可诱导产生针对PRRSV的特异性ELISA抗体,但是此抗体没有中和活性;后者不能诱导免疫小鼠产生PRRSV特异性抗体。结果表明,中和抗体的产生不但与A、B表位的空间构象有很大的关系,如果蛋白质分子质量过小也不能诱导机体产生有效的免疫反应。     

PRRSV中和表位串联Fc分子的表达与免疫原性鉴定

为融合表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）中和表位和Fc分子,首先合成PRRSVGP3和GP5的串联B细胞中和表位与鼠Ig G1-Fc的m Fc-GP35-Bp基因片段,将其克隆到pFastBac载体上,构建重组质粒pFastBac-m Fc-GP35-Bp,经蓝白斑筛选出重组杆粒Bacmid-m Fc-GP35-Bp,并转染昆虫Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBV-m Fc-GP35-Bp。通过Western-blot分析重组蛋白的反应原性,免疫小鼠后,通过间接ELISA检验其免疫原性,病毒中和试验检测中和抗体水平。结果显示,m Fc-GP35-Bp蛋白在昆虫Sf9细胞中获得表达,且可分泌至上清;用m Fc-GP35-Bp蛋白免疫小鼠后,ELISA测定抗体效价可达1∶100 000,三免后第4周仍可检测到较高抗体水平;中和抗体效价介于1∶40和1∶80之间。结果表明,表达的重组m Fc-GP35-Bp蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,可刺激机体产生中和抗体,与Fc分子融合表达延长了抗体在血清中存在的时间,本试验为PRRSV中和表位疫苗的研发奠定了基础。     

肠炎沙门菌效应蛋白AvrA的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)avr A基因功能及其在感染过程中的表达分布情况,本研究通过PCR技术克隆获得了avr A基因,并构建了肠炎沙门菌Avr A原核表达载体p Cold-avr A,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达;表达蛋白经纯化后免疫小鼠获得Avr A多克隆抗体,通过Western-blot检测了抗体特异性。结果显示,成功构建了表达载体p Cold-avr A,并获得了纯化的Avr A蛋白,成功制备了小鼠抗Avr A蛋白的多克隆抗体,可用于检测细菌Avr A蛋白的表达。本研究成功获得纯化的Avr A蛋白及其多克隆抗体,为进一步探讨Avr A在肠炎沙门菌感染过程中所发挥功能奠定了基础。     

重组猪干扰素α的真核表达纯化及其单克隆抗体制备

为了获得猪源干扰素α(PoIFN-α)的单克隆抗体,本研究首先将PoIFN-α基因连接到pcDNA3.1真核表达载体从而构建rPoIFN-α质粒,通过真核表达系统（ExpiCHOTM）表达蛋白,并用亲和层析技术纯化后对重组蛋白进行鉴定;以重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠后进行细胞融合,用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,亚克隆后通过制备腹水得到单克隆抗体,纯化制备的抗体并鉴定。结果显示,成功构建了rPoIFN-α质粒,通过ExpiCHOTM表达系统成功表达出正确大小的可溶性蛋白,分子质量为20 ku;通过间接ELISA筛选和5次亚克隆,得到1株能稳定分泌抗IFN-α蛋白的单克隆细胞株（3c6）,亚型鉴定为Ig G1亚型、Ig Gκ轻链;Western-blot结果显示,抗体可以特异识别IFN-α,抗体纯化后效价检测可达1∶256 000。上述结果表明,本试验制备的rPoIFN-α蛋白纯度高,单克隆抗体特异性强,可以在以后的研究中用于建立不同的IFN分子的检测方法,为研究猪病毒感染和免疫过程中不同细胞因子的应答情况提供便利。