伪狂犬病病毒分子生物学的研究进展

介绍了伪狂犬病病毒基因组的特点及编码蛋白,论述了伪狂犬病病毒分子生物学诊断方法,包括核酸探针诊断方法、PCR诊断方法、LAMP诊断方法、鉴别诊断方法,并就其基因工程疫苗方面的研究进行了着重阐述。     

伪狂犬病病毒糖蛋白的研究进展

伪狂犬病病毒糖蛋白的研究进展向开军１）张楚瑜（武汉大学病毒研究所４３００７２）伪狂犬病病毒（ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｒｕｓ，ＰｒＶ）是引起家畜和野生动物Ａｕｊｅｓｚｋｙ′ｓ病（伪狂犬病）的一种疱疹病毒，其所致症状为神经功能失调、呼吸紊乱及繁殖障碍...     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株的分离鉴定

为获得1株猪伪狂犬病病毒贵州分离株,将贵阳市某猪场送检的流产胎儿病料经一系列处理后接种Vero细胞,并对分离毒株分别进行了病毒理化特性、电镜形态观察、中和试验、动物接种试验、核酸检测等鉴定。当盲传至第3代时,出现细胞变圆变亮、脱落、呈拉网状特征的细胞病变;分离毒不耐酸和热,对5-碘脱氧尿核苷和有机溶剂氯仿敏感,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;透射电镜下可见位于囊泡中呈近圆形、有囊膜、150～180 nm大小的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;将分离毒株接种家兔,能引起家兔奇痒、麻痹死亡;PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定许伟琦朱璇孙泉云刘红刘佩红李维功沈莉萍（上海市畜牧兽医站２０１１０３）猪的伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）引起的一种危害严重的急性败血性传染病，主要以新生仔猪的急性死亡及４周龄以上的仔猪表现神经症状为特征。本病最早发生于美国...     

Toll样受体7介导的抗病毒天然免疫反应研究进展

概述了Toll样受体(TLRs)的发现、种类及其作用模式,重点介绍了TLR7的分子结构、组织分布、识别的配体以及依赖MyD88接头分子的信号转导通路,最后,综述了TLR7介导的抗病毒效应的研究进展。提出,对TLR7及其作用机制的研究必将有助于新型动物用疫苗的创制。     

猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定

从上海某猪场发病仔猪体内分离到 1株病毒 ,该毒株能在鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK2 1、ST、PK15细胞上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化 ,克隆毒株在BHK2 1细胞上的TCID50 为 5 0 μL 10 -6.68稀释液。该病毒能被伪狂犬病毒 (PRV )阳性血清中和。接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应。电镜观察可见直径 110～ 180nm的典型疱疹病毒粒子。用该病毒接种兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状。表明该分离毒株为PRV。     

猪伪狂犬病的诊断及病毒分离

猪伪狂犬病是由疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科的伪狂犬病毒 (PRV ,亦称猪疱疹病毒Ⅰ型 )引起的一种急性传染病。近年来 ,随着我国集约化养猪业的发展 ,从国外引进种猪较多 ,从而导致猪伪狂犬病的发生越来越严重 ,湖北、重庆、广东、江西、上海、广西等地都有本病发生的报道。湖北省宜城市某猪场的猪发生疑似伪狂犬病 ,笔者进行了临床检查 ,并采集病料进行了系统诊断及病毒分离鉴定。1　临床症状该场 80 %的妊娠母猪在预产期前 8～ 15d产死胎 ,但无其他临床症状 ,采食、体温均正常。初生仔猪表现怕冷 ,颤抖 ,拉稀 ,呕吐 ,呼吸困难 ,体温升高到 …     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.     

反向表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒Bartha-K61株的构建

为构建以伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株为载体的反向表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(rgp)的重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,经酶切鉴定为反向连接,阳性重组子命名为p8AA-EGFP/rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得rPRV/EGFP/rgp重组病毒.对纯化后的重组病毒进行RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光鉴定.结果表明,重组病毒的效价(TCID50)为108.25/mL;外源基因在细胞内得到了有效的表达,并具有良好的免疫反应性和遗传稳定性.     

伪狂犬病病毒HNX株增殖特性及其致病性的研究

将伪狂犬病病毒(PRV)HNX株和经典Ea株分别接种PK-15和Vero细胞,观察细胞病变情况,用TCID50法检测HNX株的病毒效价并绘制一步生长曲线。将15头50日龄的PRV阴性仔猪随机平均分为3组,其中2组分别滴鼻接种1mL 107 TCID50的HNX株和Ea株病毒,第3组滴鼻接种1mL DMEM培养液作为空白对照。结果显示,HNX株和Ea株在这2种细胞中产生的CPE差异明显。病毒一步生长曲线显示,HNX株早期增殖速度明显比Ea株快。动物试验结果显示,接种HNX株的试验猪临床症状典型,体温和排毒量明显高于Ea株组,HNX株的致死率为60%(3/5),Ea株的致死率为0。HNX株造成的病理损伤比Ea株严重。结果表明,HNX株能快速适应宿主细胞,相关增殖特性发生明显改变,并且对仔猪的致病性明显增强。     

猪伪狂犬病病毒FJNP株的分离鉴定

从福建省某猪场采集的发病仔猪大脑和内脏病料中分离到一株病毒。病毒接种PK细胞的结果显示,PK细胞出现典型的细胞病变;PCR反应扩增出特异性的片段,与经典毒株闽A株一致;免疫荧光试验中出现绿色荧光;病毒接种家兔后引起典型的伪狂犬病症状并死亡。上述结果充分证实,本研究分离的毒株为伪狂犬病病毒,随之将其命名为伪狂犬病病毒FJNP株。本研究结果丰富了福建省伪狂犬病流行病学资料,为开发猪伪狂犬病病毒新型疫苗提供了依据。     

变异猪伪狂犬病病毒自然感染仔猪的病理组织学研究

为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异株对自然感染仔猪的组织病理损伤,对自然感染发病仔猪进行病理剖检、细菌分离、病毒PCR鉴定、病毒分离培养、病毒粒子观察、基因序列分析及病理组织学观察,证实该发病仔猪为典型的PRV病毒变异株感染发病。病理剖检和病理组织学检查结果显示,发病仔猪脑、心脏、肝、脾、肺、肾等主要器官组织可见典型的猪伪狂犬病剖检病变和病理组织学变化。脑实质中小血管扩张充血,大量胶质细胞浸润,形成明显的血管套和噬神经元现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;全身免疫器官淋巴细胞减少等。同时发现PRV在发病仔猪全身分布广泛,且组织中病原含量与组织病理损伤程度密切相关。结果表明,自然发病仔猪感染的PRV变异毒株属于强毒株,具有较强的致病性。     

伪狂犬病病毒北京株的纯化及电镜观察

将伪狂犬病病毒（ＰｒＶ） 北京株细胞培养物经超速离心沉淀后,用质量分数３０ ％ 、３５ ％ 、４０ ％ 、４５ ％ 蔗糖密度梯度离心,收集病毒蛋白带,经１０ ｇ／Ｌ 醋酸铀负染色后电镜观察病毒粒子形态。结果表明,病毒粒子主要集中于３５ ％ ～４０ ％ 蔗糖界面处;有囊膜病毒粒子直径约为１５０ ～２１０ ｎ ｍ ,无囊膜病毒粒子直径约为１００ ～１６０ ｎ ｍ 。证明上述纯化ＰｒＶ 的方法是可行的,为今后建立分泌抗ＰｒＶ 杂交瘤细胞株及开展基因工程抗体的研究奠定了基础     

伪狂犬病病毒LAMP检测方法的建立与应用

为了能快速、高效地检测猪感染伪狂犬病病毒(PRV)的情况,本研究采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了一种检测伪狂犬病病毒的可视、灵敏、快速、特异、经济的方法。结果表明,通过LAMP检测,在65℃条件下反应60 min就能得到检测结果,检测的灵敏度达到1×100copy,比常规PCR敏感100 000倍,并可经SYBR GreenⅠ染色后通过眼观就可判定结果。本试验对8个临床样本进行了检测,结果显示,LAMP检测方法比传统PCR更具有实用性,适合基层养殖场使用。相对传统RT-PCR和荧光RT-PCR而言,LAMP检测只需要45~60 min,本研究能在更短的时间确定检测猪感染伪狂犬病病毒的情况,并具有高灵敏度。     

陕A株伪狂犬病病毒的分离与鉴定

陕西省大荔县八鱼公社西营大队的耕牛于1978年2月底发生疫情。经过对疫情的调查与研究,已诊断为牛伪狂犬病(Pseudrabies)或称奥叶兹基氏病(Aujeszkys disease)。由于牛伪狂犬病在西北地区未见报道,陕西省仅初次发生,因此,有进一步分离培养病毒的必要。其二,为了准备应用福建省兽医生物药品厂制造的牛伪狂犬病疫苗,故有目的地通过闽A株伪狂犬病病毒的免疫血清鉴定陕A株伪狂犬病病毒,为今后有效控制此病提供可靠的依据。所以,将采取的病料进行了伪狂犬病病毒(以下简称PrV)的分离与鉴定。现将结果报告如下。     

伪狂犬病病毒湖北株的电镜观察及基因诊断

伪狂犬病病毒湖北株的电镜观察及基因诊断王家富丁建华张楚瑜罗满林（武汉大学生命科学院４３００７２）伪狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）是由疱疹病毒（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）引起的多种家畜和野生动物的一种急性传染病，尤以对猪的危害最大。该病以母猪繁殖障碍...     

伪狂犬病病毒变异株Fujian-LY对生长育肥猪的致病性研究

将6头80日龄伪狂犬病病毒(PRV) g B、g E抗体均为阴性的生长育肥猪随机分成对照组和感染组,每组3头。感染组试验猪通过颈部肌肉接种Fujian-LY株2m L,对照组猪经相同途径接种等体积的DMEM,每日观察记录试验猪的发病及死亡情况,试验期为7 d。结果显示,感染组育肥猪临床症状表现明显,在感染1 d后体温均开始升高,随着病情的发展,表现咳嗽、喘气、流鼻涕等典型的呼吸道症状,至试验结束未出现死亡。病理剖检显示,与对照组相比,感染育肥猪除脑部病变明显外,心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织均未出现明显的肉眼可见病变。组织病理学检查结果显示,PRV Fujian-LY株已对感染育肥猪的多个主要器官组织造成了较为严重的病理损伤:脑实质中小血管扩张充血,血管周围有淋巴细胞包围的"血管套"现象;肝索紊乱、肝细胞坏死;免疫器官中淋巴细胞减少等。同时采用PCR及免疫组织化学方法对这些组织进行检测均呈PRV阳性。g B、g E抗体检测结果显示,感染猪在感染后第7天PRV g B、g E抗体均开始转阳。上述结果表明,PRV Fujian-LY株对生长育肥猪具有较强的致病性,在发病猪体内分布广泛。     

猪伪狂犬病病毒SL株gK基因的生物信息学分析

对猪伪狂犬病病毒(PRV)四川分离株(SL株)gK基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对gK基因进行了同源性、遗传进化树、密码子偏向性、蛋白质二级结构预测及抗原表位分析。结果显示,成功克隆了PRVSL株gK全基因,其编码区长939bp,编码313个氨基酸残基,与其他PRV分离株核苷酸序列同源性为97.6%～99.9%,与国外分离株的同源性略高于国内分离株。gK基因存在4个跨膜区及1个明显的CpG岛。表明成功克隆了PRVSL株gK基因,该基因具有潜在的抗原性。     

猪伪狂犬病病毒MQ18变异株的分离鉴定

为了解福建省猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的病原学特性及分子遗传变异情况,本研究用羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)从疑似暴发伪狂犬病猪场死亡的育肥猪中分离到1株病毒,该病毒能够产生典型的PRV细胞病变,病毒液接种小鼠(0.1 mL/只)及成年兔(0.5 mL/只)在48～60 h死亡,均表现出典型的伪狂犬病症状。经PCR试验、电镜观察及特异性血清间接免疫荧光试验鉴定为伪狂犬病病毒,命名为MQ18株;并对其进行病毒效价的测定及gC、gE基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示,分离株TCID50为10~(-7.71)/0.1 mL;将其gC和gE基因序列与国内外17个PRV参考毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性分别为93.5%～99.9%和97.8%～100%,氨基酸序列同源性分别为88.7%～99.8%和95.7%～100%;分子遗传进化树分析显示,gC和gE基因均与国内近6年分离的PRV变异株集聚在一起,属于同一个进化分支;与经典株相比,gC基因编码的氨基酸序列在第63～69位有1个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,gE基因编码的氨基酸序列分别在第48位和第496位有1个天冬氨酸(D)的插入,与PRV变异株变异位点相一致。以上结果证实,从发病猪群中分离到1株PRV变异株,本研究结果为选择合适疫苗来防控猪伪狂犬病以及病原学研究提供了参考。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株TK基因的分离鉴定

提取伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA,用限制性内切酶KpnⅠ充分消化,回收5.9×103b片段(J片段),将其克隆于质粒pUC119 KpnⅠ位点上,获得pBKJ.用一对针对PRV TK基因的特异性引物对重组质粒进行PCR鉴定,证明其中含有PRV TK基因.然后用KpnⅠ、PstⅠ和BamHⅠ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱.进一步研究证实TK基因位于其中的KpnⅠ-BamHⅠ或KpnⅠ-Pst Ⅰ片段中.然后亚克隆此KpnⅠPstⅠ片段,并进行了序列测定.