猪瘟病毒表面抗原E2-E~(rns)蛋白在拟南芥种子中的表达及抗原性分析

根据拟南芥密码子偏好性对猪瘟病毒表面抗原基因E2和E~(rns)的序列进行优化,并将优化的E2-E~(rns)基因克隆入植物表达载体中;利用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,通过1%草铵膦喷洒筛选阳性植株,利用PCR鉴定阳性植株;提取阳性种子总蛋白进行ELISA检测评价重组E2-E~(rns)蛋白的免疫反应原性;用E2-E~(rns)融合蛋白灌胃免疫小鼠并检测其血清中的特异抗体效价。结果,成功构建了由菜豆蛋白启动子驱动的种子特异性表达目的基因的植物表达载体p PHAP1301-E2-E~(rns),并利用拟南芥成功表达了猪瘟病毒表面抗原E2-E~(rns)融合蛋白。免疫试验结果表明,通过拟南芥表达的E2-E~(rns)融合蛋白具有良好的免疫反应原性。结果表明,本研究获得了表达E2-E~(rns)蛋白的转基因拟南芥,小鼠口服植物源E2-E~(rns)融合蛋白具有良好的抗原性,这为深入研究利用植物表达猪瘟病毒表面抗原奠定了基础。     

牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达

利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。     

农杆菌介导O型口蹄疫病毒P12A~*3C基因转化玉米的研究

通过农杆菌介导转化法,将O型口蹄疫病毒P12A*3C基因转化到玉米自交系18-599的Ⅱ型胚性愈伤组织中,经潮霉素抗性筛选获得25株抗性再生植株。对转基因植株的PCR检测,PCR-Southern及RT-PCR检测表明,目的基因P12A*3C已经整合到玉米基因组中并得到表达。T1代植株的PCR检测表明,P12A*3C基因能稳定遗传,本研究为转基因玉米口蹄疫可饲疫苗的生产奠定了试验基础。     

非洲马瘟病毒VP7基因在重组杆状病毒中的表达及抗原性检测

利用pFastBacHTA质粒将非洲马瘟病毒(AHSV)血清4型的VP7基因重组入杆状病毒,并感染昆虫细胞Sf9。结果显示,VP7蛋白在真核细胞内获得了表达,但表达量较低。免疫印迹试验证实,VP7重组蛋白具有较好的免疫原性,将其作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测AHSV的间接酶联免疫吸附试验方法。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

脑心肌炎病毒VP1结构蛋白的可溶性表达及鉴定

为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件,并通过Western-blotting检测最佳条件下表达蛋白的免疫活性。PCR、酶切鉴定及测序结果表明,VP1基因已克隆入pGEX-4T-1质粒。经优化,确定VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当D600nm值为0.4～0.6时,以0.25mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达12h。Western-blotting结果显示,诱导表达的蛋白具有免疫活性。     

口蹄疫病毒O/China/99株VP1基因植物种子特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDVVP1的核苷酸序列设计并合成引物,从种子特异性启动子7S质粒pU82质粒中扩增7S启动子,经HindⅢ和BamHⅠ酶切,与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接,经酶切、PCR鉴定及序列分析,种子特异性表达载体p7SBin438构建完成。从FMDVVP1基因的pGEMVP1质粒中扩增VP1基因,经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后,与p7SBin438质粒酶切后的大片段连接,经酶切、PCR及测序鉴定,FMDVVP1基因已置于种子特异性启动子7S下游,成功构建了FMDVVP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438VP1。通过三亲交配法,将表达载体p7SBin438VP1导入根癌农杆菌,为研究FMD可饲疫苗奠定了基础。     

多杀性巴氏杆菌IbeB重组蛋白诱导小鼠抗攻击感染的免疫保护力

为了研究猪多杀性巴氏杆菌IbeB重组蛋白(rIbeB)的免疫保护性,根据GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌ibeB基因序列设计1对引物扩增ibeB基因,并重组至pET-28a(+)构建重组表达质粒pET-ibeB,转化到大肠杆菌BL21(D E3),经IPTG诱导获得rIbeB。生物信息学分析表明,猪多杀性巴氏杆菌ibeB基因长1 392 bp,编码蛋白质含463个氨基酸。该蛋白质的理论分子质量为51.98 ku,具有2个外排蛋白结构域,属外膜外排蛋白超家族。蛋白序列比对发现,不同血清型的多杀性巴氏杆菌IbeB的同源性达99%以上。rIbeB诱导小鼠的免疫保护结果表明,第3次免疫后第14天小鼠血清中IgG抗体水平显著升高,明显高于佐剂对照组。攻毒后,对照组小鼠第3天的存活率为20%,7 d后全部死亡;免疫组第3天的存活率达70%,第7天的存活率为40%。结果表明,rIbeB蛋白具有很好的免疫原性,可诱导小鼠产生部分免疫保护力。     

猪丹毒杆菌表面抗原SpaA的原核表达纯化及免疫原性验证

本研究制备了一种具备优良免疫原性的猪丹毒杆菌表面抗原重组蛋白。采用基因调取的方式,构建质粒并亚克隆到表达载体pET28a上,进一步将改造质粒转化到大肠杆菌感受态BL21细胞中,构建了1株猪丹毒SpaA全基因重组表达菌株。之后通过IPTG诱导表达、镍离子层析柱分离纯化、梯度透析获得高纯度重组SpaA蛋白。经免疫攻毒试验验证,重组SpaA蛋白能够有效保护小鼠和猪免于猪丹毒杆菌强毒攻击,其中小鼠的重组SpaA蛋白最小免疫剂量为每只2.0μg,100μg的重组SpaA蛋白能够保护猪免于猪丹毒杆菌强毒株感染。以重组SpaA蛋白作为组分与猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗共同免疫小鼠,结果显示该混合疫苗对于猪丹毒杆菌及猪多杀性巴氏杆菌均有良好的保护效果。本研究结果证实,重组SpaA蛋白是我国现行猪丹毒杆菌传统灭活疫苗升级换代的理想候选抗原,同时也具备良好的抗原相容性,其高纯度及低免疫剂量的特点也为其他组分提供了充足的剂量空间。     

A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。     

猪囊尾蚴T24基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增猪囊尾蚴T24免疫原基因,将扩增产物与pGEM-T easy载体连接,重组质粒经PCR、酶切鉴定后进行测序;构建T24基因的pGEX-4T-1原核表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blotting;用所表达的蛋白免疫小鼠,经ELISA检测血清抗体,验证其免疫原性。结果显示。所克隆的T24基因片段长716 bp。含有1个678 bp的开放阅读框,其编码226个氨基酸,与已报道的猪囊虫T24基因核苷酸序列同源性为100％;表达的融合蛋白大小为40 ku,并能被猪囊虫阳性血清识别;免疫小鼠在免疫1周后即可检测到血清抗体,第30 d达到较高水平,表明该融合蛋白具有较好的免疫原性。     

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。     

水牛匈爱病毒结构蛋白VP1的截短表达及多克隆抗体的制备

为了制备水牛匈爱病毒（BufHuV）结构蛋白VP1截短基因的多克隆抗体,将病毒的VP1截短基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）获得重组质粒pET-32a-BufHuV-VP1,重组质粒转化至BL21感受态细胞（DE3）后诱导表达,VP1截短蛋白的分子质量约为31.5 ku,主要以包涵体的形式表达。以纯化好的重组蛋白免疫昆明小鼠以制备多克隆抗体,通过Western-blot与IFA鉴定其特异性。结果显示,制备的小鼠多克隆抗体能与纯化的VP1重组截短蛋白和感染BufHuV的细胞表达的VP1特异性结合,表明多克隆抗体具有良好的反应原性和特异性。水牛匈爱病毒VP1截短重组蛋白及其多克隆抗体的成功制备为研究BufHuV致病机制、VP1蛋白功能以及血清学检测方法的建立提供了材料基础。     

表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究猪流行性腹泻病毒中和抗原位点(COE)基因在乳酸菌中的表达情况,进而探讨重组乳酸菌的免疫原性。将COE基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG-1中,构建重组表达载体pPG-1-COE,并将其电转化入干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中,应用Western-blotting、间接免疫荧光染色和全细胞ELISA检测重组蛋白的表达情况,用重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠,测定免疫应答水平。结果表明,COE可在构建的重组干酪乳杆菌表达系统中表达,目的蛋白定位于细胞表面。在免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P0.01);血清具有中和活性(1∶12);脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P0.01)。证实,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。     

新型环形病毒AGV2的VP3基因的克隆表达及多抗制备

新型环形病毒AGV2最早于2011年报道。为建立AGV2血清学诊断方法,并探究其VP 3基因功能,本研究对AGV2的VP3基因进行了克隆、表达及多抗制备。通过将AGV2 VP3基因克隆进pGEX-6p-1原核表达载体,获得了可溶性GST-VP3融合表达产物,并利用纯化的GST-VP3蛋白制备了小鼠抗GST-VP3多克隆抗体。同时构建获得了pcDNA3.1-VP3以及EGFP-VP3两个AGV2 VP 3基因真核表达载体。间接免疫荧光试验以及EGFP观察发现,AGV2的VP3蛋白及其EGFP融合蛋白EGFP-VP3在HCT116肿瘤细胞中的表达集中于细胞核,且呈散在点状分布,类似凋亡小体。这些AGV2 VP3表达载体的构建,表达产物、小鼠多克隆抗体的获得及其在肿瘤细胞中的表达分布,为进一步研制AGV2血清学诊断方法提供了材料,为深入探究AGV2 VP3的生物学功能打下了基础。     

口蹄疫病毒A-O型多表位二价融合抗原的构建及其在小鼠模型中的免疫学功能

为了研制广谱高效的新型口蹄疫病毒(FMDV) A-O型重组多表位二价疫苗,以结核分支杆菌热休克蛋白70(mHSP70)的C端肽结合区作为多表位免疫原的载体蛋白,将A型和O型FMDV代表性毒株VP1上的B细胞表位以及非结构蛋白3A上的T细胞表位基因进行串联合成后与mHSP70的肽结合区编码基因相连接,构建重组质粒pAO-HSP,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白经过纯化和鉴定后免疫BALB/c小鼠,检测相应的体液免疫应答和细胞免疫应答。结果显示:重组蛋白pAO-HSP在BL21(DE3)中能够以可溶性形式表达,纯化后经Western blot检测能够与感染了A型和O型FMDV猪的阳性血清发生特异性反应,并能够刺激小鼠产生抗A-O型FMDV特异性抗体。免疫后小鼠的脾淋巴细胞在A型、O型灭活FMDV刺激后,均出现显著的增殖现象,同时可以产生相关的Th1或Th2型细胞因子。本研究成功构建重组抗原pAO-HSP,并在小鼠模型中初步显示出了良好的免疫效果,为新型FMDV A-O型多表位二价疫苗的研发奠定基础。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位区与猪细小病毒VP2真核表达质粒的构建及免疫效果

筛选了3个位于流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白上不同位置的抗原表位区基因,利用重叠PCR方法分别与猪细小病毒(PPV)VP2基因相连。将目的基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2。将重组质粒在无免疫佐剂参与的情况下免疫BALB/c小鼠,同时设空质粒接种组及PBS缓冲液接种组作为空白对照,采用ELISA法、淋巴细胞增殖试验和流式细胞仪技术分别对抗体水平、脾淋巴细胞转化功能和小鼠外周血中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞数进行检测。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2接种小鼠后,都能诱导小鼠产生JEV、PPV特异性抗体,并且促进脾淋巴细胞增殖。试验组与对照组比较差异极显著(P0.01);试验组小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞数在首疫后第7天高于对照组(P0.01),CD8+T淋巴细胞数在首免后第14天高于对照组(P0.01)。pcDNA3.1-EB-VP2免疫组小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平均高于pcDNA3.1-EA-VP2和pcDNA3.1-EC-VP2免疫组。表明,用JEV E蛋白抗原表位区基因与PPV VP2基因构建的真核表达质粒能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区的原核表达及其表达产物免疫原性的研究

为了构建鹅细小病毒亚单位疫苗候选菌株,通过软件优化分析预测鹅细小病毒结构蛋白VP3的抗原表位分布,并设计抗原表位富集区的引物,PCR扩增获得目的片段,双酶切定向连接于pET-30a表达载体,转化BL21表达菌株诱导表达,获得目的蛋白,使用该蛋白免疫SPF鸡,制备抗血清,使用鹅胚成纤维细胞原代细胞进行中和效价的测定。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a-VP3,通过条件优化蛋白以可溶性形式存在,免疫制备的抗血清中和效价能够达到-2.608。结论:本研究以可溶性形式成功表达了鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区,且该蛋白作为免疫原具有很好的产生中和抗体的能力。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。