旋毛虫谷氨酸脱羧酶基因的原核表达及其活性研究

采用RT-PCR从旋毛虫中扩增出谷氨酸脱羧酶(TsGAD)基因全长,将其克隆到表达载体pET-30a(+)后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,应用比色法鉴定表达产物(rTsGAD)的酶活性,并用纯化的GAD蛋白制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了重组质粒pET-30a(+)-TsGAD,经SDS-PAGE分析,rTsGAD蛋白的分子质量约为57ku。利用比色法测得粗提的rTsGAD具有酶活性,酶活力为1.5U。制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶65 536。Western-blot分析结果显示,该多克隆抗体与TsGAD具有较强的反应性。结果表明,本试验成功原核表达了rTsGAD,并制备了多克隆抗体,为TsGAD定位以及进一步研究旋毛虫谷氨酸依赖型抗酸机制奠定了基础。     

维氏气单胞菌脂蛋白的原核表达及其抗血清的抗菌作用研究

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的生物学功能,对脂蛋白基因进行原核表达,对表达产物进行鉴定并制备多克隆抗体研究其抗菌效应。通过PCR扩增脂蛋白基因,连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-Lpp。将重组质粒pET-32a(+)-Lpp转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达。利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,并采用SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白的表达产物。用纯化后的重组脂蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,多抗经皮下接种小鼠研究其抗菌效应。结果显示,经酶切鉴定和序列测定发现重组质粒pET-32a(+)-Lpp构建成功。通过SDS-PAGE检测发现,重组蛋白LPP在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为69 ku。Western-blot结果显示,纯化后的重组蛋白LPP为单一条带。制备的多克隆抗体的效价为102 400,该多抗可提高荷菌小鼠的生存率,减少脾荷菌量。因此,本实验成功构建了重组质粒pET-32a(+)-Lpp,表达并纯化了重组蛋白LPP,制备的多抗具有抗菌作用,为该蛋白生物学功能的研究及疫苗的制备奠定了基础。     

旋毛虫醛缩酶基因的克隆表达及重组蛋白酶比活性的分析

根据旋毛虫醛缩酶(aldolase,ALD)基因序列设计1对特异性引物,以肌幼虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增肌幼虫的ALD基因。将该基因克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,再将该基因亚克隆到pET-32a(+)载体中,测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后用SDS-PAGE进行分析。结果显示,该基因与GenBank中旋毛虫醛缩酶基因的相似性高达99%。该基因在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白大小约为57ku,重组蛋白在菌体上清和沉淀中均有存在。Western-blot分析显示,重组蛋白可被人工感染旋毛虫的大鼠血清所识别。通过3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法测定该重组酶的比活性,发现该重组蛋白的最佳反应温度和pH值分别为35℃和7.0。结果表明,该重组蛋白具有一定的抗原性和酶比活性。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。     

狂犬病病毒核蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

为获得狂犬病病毒(RV)核蛋白抗原,采用RT-PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了RV核蛋白基因,分别亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+)中,经PCR和双酶切鉴定以及序列测定,重组质粒构建成功。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,表达的核蛋白再经Ni2+-NTA亲和层析纯化。结果显示,核蛋白在pET-32a(+)中的表达量(30.4%)高于在pET-28a(+)中的表达量(19.4%),培养物中的高纯度核蛋白产量分别为13.6和8.45 mg/L。经Western-blotting检测,不同载体表达的核蛋白均可被兔抗RV多克隆抗体特异识别,表明核蛋白具有良好的反应原性。     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12 000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。     

旋毛虫Ts-Sp-7蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备

为给旋毛虫病的诊断及疫苗研制提供备选抗原,对本实验室获得的旋毛虫Ts-Sp-7基因(GenBank登录号EU263332.1)进行PCR扩增,构建原核表达载体,进行表达纯化,Western-blot分析。制备多克隆抗体进行间接免疫荧光分析。通过PCR扩增出1 372 bp的Ts-Sp-7基因。SDS-PAGE结果显示,该蛋白大小为46 ku左右,与理论分子质量一致。Western-blot结果显示,该目的蛋白与10 000条/头感染剂量不同感染时间的猪阳性血清均呈现特异性条带。制备的多克隆抗体效价为1∶350 000。Ts-Sp-7多克隆抗体的间接免疫荧光鉴定结果显示,Ts-Sp-7蛋白在旋毛虫肌幼虫期存在于虫体表面。     

旋毛虫HSP70基因的原核表达及其免疫原性

利用RT-PCR方法扩增旋毛虫HSP70基因,将其扩增产物克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经限制性酶切后与pET-28a(+)载体连接,进一步转化至感受态细胞Transetta(DE3)中,用IPTG诱导表达重组旋毛虫HSP70。以纯化的重组HSP70制备多克隆抗体,并对HSP70进行免疫印迹分析及免疫组织化学染色。结果表明,重组质粒的鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在70ku处获得一目的条带;免疫组织化学染色结果显示,该HSP70具有很好的免疫原性。证实,成功构建了重组表达质粒pET28a-HSP70,为深入研究旋毛虫HSP70的功能奠定了基础。     

牛结节性皮肤病病毒ORF006蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究牛结节性皮肤病病毒（LSDV）ORF006蛋白的生物学功能,制备了ORF006基因的多克隆抗体,用PCR技术获得LSDV ORF006的基因片段克隆至pET-28a原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。结果显示,LSDV ORF006基因全长约696 bp;pET-28a-ORF006重组质粒在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约28.0 ku目的蛋白;ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶102 400;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别ORF006蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别LSDV感染MDBK细胞表达的ORF006蛋白。本研究为进一步探究LSDV ORF006蛋白生物学功能奠定了基础。     

新型鹅细小病毒VP2蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为探究造成鸭短喙与侏儒综合征的病原即新型鹅细小病毒（NGPV） VP2蛋白的生物学功能,根据NGPV SD株序列,扩增VP2基因克隆至原核表达载体pET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白。将纯化的蛋白按照标准程序免疫7周龄BALB/c小鼠制备多克隆抗体。结果显示,NGPV VP2基因全长为2 199 bp;通过大肠杆菌BL21(DE3)成功表达出大小约为83 ku的His-VP2融合蛋白。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别受感染细胞中的NGPV和鹅细小病毒。综上所述,本研究成功表达并纯化了VP2蛋白,并成功制备了效价高反应性好的多克隆抗体,为进一步探究NGPV VP2蛋白生物学功能奠定了基础。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)核衣壳(N)蛋白多克隆抗体,采用PCR方法扩增SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株N基因片段,并对N基因的序列以及N蛋白氨基酸突变位点进行分析。随后,将N基因片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)构建重组质粒,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化N蛋白,通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。结果表明,扩增的N基因片段和所构建的重组质粒正确无误,成功诱导表达出可溶性重组蛋白SADS-CoV-N,分子质量约为67 ku,最佳诱导时间为6 h。Western-blot以及间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体能特异性检测SADS-CoV,证明重组蛋白有良好的免疫原性。本研究为后续建立SADS-CoV快速诊断方法及该病毒致病机制的深入研究奠定基础。     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

口蹄疫病毒前导蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

前导蛋白(L~(pro))是口蹄疫病毒(FMDV)编码的重要毒力因子,在拮抗宿主抗病毒反应中发挥多种功能。为了获得抗L~(pro)的抗体以研究L~(pro)的功能,本研究将L基因克隆到pET-28a(+)原核表达质粒中,构建了重组表达质粒pET-28a-L,转化至大肠杆菌BL21中进行重组蛋白的诱导表达,所获得重组His-L~(pro)主要以包涵体形式存在,利用Ni-NTA柱纯化获得了高纯度的His-L~(pro),将His-重组L~(pro)与弗氏佐剂混合乳化后免疫新西兰大白兔,制备了高效价的L~(pro)兔多克隆抗体血清。通过免疫荧光试验(IFA)、免疫印迹试验(WB)检测L~(pro)兔多克隆抗体血清的反应原性。结果显示,该多抗血清能够特异性识别FMDV感染BHK21细胞后表达的L~(pro),表明本研究制备的L~(pro)多抗血清具有很好的反应原性,为深入研究L~(pro)功能及其拮抗宿主天然免疫的作用机理奠定了基础。     

马链球菌兽疫亚种串联表达蛋白对小鼠免疫效果的评价

根据马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzP)、纤维结合素结合蛋白(FNZ)、IgG结合蛋白(ZAG)的基因序列,分别设计并合成引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246的基因组为模板,扩增szp(527~1 044bp)、fnz(1 012~1 519bp)、zag(134~664bp)基因序列,并构建原核表达载体pET-32a(+)-szp、pET-32a(+)-fnz、pET-32a(+)-zag。确定诱导表达的三种蛋白都具有免疫原性后,通过PCR串联的方法,将以上3个目的片段同时串联克隆到表达载体pET-32a(+)中。重组质粒转化入大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达分子质量约为74ku的串联融合蛋白SzP-FNZ-ZAG。免疫印迹分析结果表明,上述融合蛋白能够与ATCC35246鼠源多克隆抗体发生结合反应。分别用纯化的单个蛋白和串联重组蛋白免疫ICR小鼠,能够诱导免疫小鼠产生较高效价的血清抗体,串联重组蛋白对致死剂量的马链球菌兽疫亚种强毒菌株的攻击具有90%的免疫保护率,显著高于单个蛋白。RT-PCR检测显示,免疫小鼠IL-4、IFN-γ基因的转录水平显著高于空白对照组小鼠。     

鸭肠炎病毒ul47基因的原核表达及其抗血清中和活性的鉴定

提取鸭肠炎病毒(DEV)基因组DNA,采用PCR方法扩增获得了DEVul47基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-30a-ul47,并转化受体菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析。结果显示,ul47基因在大肠杆菌Rosetta中获得与预期大小相符的表达蛋白。利用Ni-NTA纯化表达蛋白,制备了兔抗DEV UL47蛋白的多克隆抗体,经琼脂双扩散测定,该抗血清效价为1∶16。间接免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验结果显示,DEV UL47蛋白主要定位于感染细胞的细胞质和细胞膜,制备的兔抗DEV UL47多克隆抗体对DEV有中和活性。     

水牛匈爱病毒结构蛋白VP1的截短表达及多克隆抗体的制备

为了制备水牛匈爱病毒（BufHuV）结构蛋白VP1截短基因的多克隆抗体,将病毒的VP1截短基因克隆至原核表达载体pET-32a（+）获得重组质粒pET-32a-BufHuV-VP1,重组质粒转化至BL21感受态细胞（DE3）后诱导表达,VP1截短蛋白的分子质量约为31.5 ku,主要以包涵体的形式表达。以纯化好的重组蛋白免疫昆明小鼠以制备多克隆抗体,通过Western-blot与IFA鉴定其特异性。结果显示,制备的小鼠多克隆抗体能与纯化的VP1重组截短蛋白和感染BufHuV的细胞表达的VP1特异性结合,表明多克隆抗体具有良好的反应原性和特异性。水牛匈爱病毒VP1截短重组蛋白及其多克隆抗体的成功制备为研究BufHuV致病机制、VP1蛋白功能以及血清学检测方法的建立提供了材料基础。     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。     

十二指肠贾第虫γ贾第素基因的原核表达及其表达产物的亚细胞定位

为了对十二指肠贾第虫(简称贾第虫)γ贾第素(γ-giardin)进行原核表达及亚细胞定位,研究其生物学功能,提取贾第虫总RNA,反转录成cDNA,经PCR获得γ-giardin基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达质粒pET-28a-γ-giardin,再转化入大肠杆菌Rosseta(DE3)后,用IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE验证,并用切胶纯化法纯化。针对重组蛋白制备了多克隆抗体,并用ELISA测定其效价,Western-blot分析其免疫原性,并利用免疫荧光定位技术对γ-giardin进行定位。结果表明,成功构建了原核表达质粒pET-28a-γ-giardin。表达的重组蛋白的分子质量约为38 ku,且以包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白的纯度高达90%以上。ELISA和Western-blot结果显示,γ-giardin抗体具有良好的抗原特异性与优异的抗原结合活性。免疫荧光定位结果表明γ-giardin主要位于贾第虫滋养体的腹吸盘。本研究为今后探讨贾第虫致病机制、临床诊断和治疗奠定了理论基础。