溶菌酶释放蛋白介导猪链球菌2型的血凝活性

比较了猪链球菌 2型 (SS2 )MRP+ 菌株HA980 1和MRP-菌株 0 0 64 44的血凝特性及溶菌酶释放蛋白 (MRP)在血凝过程中的作用。 2株菌均能凝集人A、B、O型及猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠、绵羊、山羊、水牛的红细胞 ,不凝集鸡、鲫鱼、鲤鱼、金鱼的红细胞 ,且对人、猪、兔、BALB/c小鼠、豚鼠红细胞的凝集价极显著高于绵羊、山羊和水牛 (P <0 .0 1) ;MRP+ 菌株对人、猪、兔、BALB/c小鼠和豚鼠红细胞的凝集价均极显著高于MRP-株 (P <0 .0 1)。MRP+ 株的血凝活性对热处理极其敏感 ,且凝集速度和反应温度呈负相关。半乳糖、胰酶预处理MRP+ 株菌体能完全阻断其血凝 ,葡萄糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、过氧化氢、巯基乙醇对其则无明显影响。用纯化的MRP处理红细胞、抗MRP兔血清和MRP的单克隆抗体处理菌体 ,均能显著降低MRP+ 菌株的凝集价 (P <0 .0 5 ) ,但不能完全抑制 ;用抗MRP-菌株兔血清处理菌体 ,也能显著降低MRP+ 株凝集价。试验证明 :MRP是SS2的黏附素 ,具有半乳糖特异性受体 ,且和其他毒力因子之间存在协同作用     

山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白的免疫原性

通过免疫印迹试验对山羊支原体山羊肺炎亚种M1601株外膜蛋白及M1601株全菌蛋白进行了免疫原性分析,并与绵羊肺炎支原体抗血清和丝状支原体山羊亚种抗血清进行了比较,以筛选M1601株特异性的外膜蛋白。结果表明,存在于外膜蛋白中的分子质量分别为60.0和49.7 ku的蛋白是其主要的免疫原性蛋白,也是山羊支原体山羊肺炎亚种区别于丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体的主要特异性抗原,这一结论为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制奠定了良好的理论基础。     

猪链球菌1/2型的分离鉴定与致病性研究

为精准鉴定从贵州临床发病死亡猪分离到的疑似致病菌,通过形态学观察、革兰染色镜检、生化鉴定、种特异性PCR鉴定、血清型分型鉴定及毒力基因、小鼠致病性、耐药性检测,确定分离菌株为血清型1/2型猪链球菌,携带fbps⁺、mrp⁺、orf2⁺毒力基因,不具有gapdh、sly毒力基因,小鼠LD₅₀为2.0×10⁹CFU/m L,致病小鼠肺和肝可见明显病变,对氨基糖苷类、喹诺酮类、氯霉素类和大环内酯类等多种抗生素敏感。结果表明,贵州省猪群存在致病性猪链球菌1/2型感染。     

牛型布鲁氏菌A19株外膜蛋白OMP2b的表达及鉴定

根据GenBank中的牛型布鲁氏菌基因序列,设计了1对特异性引物,以A19菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出外膜蛋白OMP2b的全长基因,将OMP2b经T-A克隆后进行了序列测定和分析。结果表明,OMP2b全长1 128bp,编码376个氨基酸。将OMP2b定向克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold TF-OMP2b,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白His-OMP2b。SDS-PAGE分析结果显示,His-OMP2b约为93ku,与预期大小一致,表明His-OMP2b表达成功;经Wes-tern-blot分析,His-OMP2b能与牛型布鲁氏菌A19株全菌兔抗血清发生特异性反应,表明His-OMP2b具有免疫反应性。     

猪链球菌2型人源分离株MRP单克隆抗体的制备与鉴定

为建立一种针对猪链球菌2型(SS2)毒力因子的特异性检测方法,研制了抗SS2溶菌酶释放蛋白(MRP)单克隆抗体(McAb),并对其生物学活性进行了分析.将表达、纯化的SS2菌株MRP免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,以纯化的MRP蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选获得了6株能稳定分泌抗MRP McAb的杂交瘤细胞系288、3G5、1G1、3G9、186和2C3.经用间接ELISA方法测定,单抗腹水的抗体效价均超过1105,杂交瘤细胞培养上清液的效价为1128～11 024.western-blotting鉴定结果表明,6株单抗均具有特异的生物学活性;以2B8单抗腹水和SS2多克隆抗血清建立的夹心ELISA方法可特异地检测MRP.     

猪链球菌2型MRP-FBP串联表达蛋白对小鼠的免疫保护力

针对猪链球菌2型(SS2)溶菌酶释放蛋白(MRP)和纤维蛋白原结合蛋白(FBP)抗原性较强的基因片段,分别设计了1对引物,用PCR扩增出了mrp基因和fbp基因的片段.利用这些片段分别构建了原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-fbp和pET32a-mrp-fbp.将这些表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了表达.SDS-PAGE分析表明,表达的MRP、FBP、MRP-FBP的分子质量分别为47、52、80 ku.Western-blot分析表明,重组蛋白MRP-FBP可被SS2阳性血清所识别.免疫保护试验表明,串联表达的融合蛋白MRP-FBP对BALB/c小鼠的保护率达80%,是目前筛选到的制备SS2亚单位疫苗保护力最高的短片段串联免疫原.     

2型猪链球菌动物致病性试验

用5株2型猪链球茵对BALB/c小鼠、猪、兔和普通小白鼠进行攻毒试验,其中SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠有致病性,其LD50分别为2.1×106、3.1×107、5.3×10 7、9.4×107,SS2-N株以2.8×108对BALB/c小鼠不致死.SS2-1株对猪有致病性,LD50为4.2×107,ID50为1.33×106,而以8×108活菌攻击对兔和普通小白鼠均未致病.表明2型猪链球茵可人工感染BALB/c小鼠和猪引起发病,2型猪链球菌MRP和EF毒力因子的表现型与其对BALB/c小鼠的致病性无相关关系,BALB/c小鼠可用作疫苗免疫试验的动物模型.     

猪链球菌2型39ku胞壁蛋白诱导巨噬细胞凋亡的研究

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)的39ku胞壁蛋白对巨噬细胞的致病作用,将39ku胞壁蛋白纯化,取小鼠腹腔巨噬细胞(murine peritoneal macrophage,MPM)和39ku胞壁蛋白(4μg/mL和40μg/mL)共孵育,用荧光显微镜观察细胞的形态学变化,以不同浓度(4～50μg/mL)39ku胞壁蛋白腹腔注射小鼠,作用6h,用DNA Ladder法检测MPM凋亡情况,以40μg/mL腹腔注射,分别作用2、4、6、8h,用流式细胞术检测MPM凋亡率,同时用试剂盒比色法检测其Caspase 3的表达动态。结果显示,低浓度(4μg/mL)诱导后MPM未见异常形态改变;而高浓度(40μg/mL)能引起典型的凋亡形态学变化,低浓度(4μg/mL)诱导后,DNA图谱与阴性对照相同;而高浓度(20～50μg/mL)诱导后均出现典型的DNALadder,且随39ku胞壁蛋白浓度增加,梯状条带更加清晰。流式细胞分析表明,MPM的凋亡率随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而增加,与对照组之间均差异极显著(P<0.01);Caspase 3的表达量随39ku胞壁蛋白作用时间的延长而上升,各时间点之间均差异显著(P<0.05)。结果表明,39ku胞壁蛋白可以诱导MPM高水平凋亡,凋亡率与39ku胞壁蛋白的作用浓度和时间之间正相关,39ku胞壁蛋白可单独作为SS2的毒力因子。     

猪链球菌2型动物致病性试验研究

选取猪链球菌2型SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7和SS2-N(国外引进)株,对BALB/c小鼠、猪、兔及普通小白鼠致病性进行试验.结果SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠半数致死量(LD50)分别为2.1×106、3.1×107、5.3×107和9.4×107,SS2-N株以2.8×108活菌对BALB/c小鼠不能致病;SS2-1株对猪LD50为4.2×107,对猪半数感染量(ID50)为1.33×106,用8.0×108活菌对兔及普通小白鼠感染均不能致病.提示猪链球菌2型人工感染可引起BALB/c小鼠和猪发病;其毒力因子溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外因子(EF)的表现型与对BALB/c小鼠的致病性无相关关系;BALB/c小鼠可用于猪链球菌(2型)病疫苗免疫试验的动物模型.     

猪链球菌的分离与鉴定

猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的不同临诊类型传染病的总称。目前许多国家和地区都有猪链球菌病的报道 ,其中以E群链球菌引起的淋巴结脓肿最常见 ,以C群链球菌引起的败血症危害最严重。国内报道的动物链球菌病以L群兽疫链球菌为主 ,其次为D群和E群。近年来 ,猪链球菌病的流行呈明显上升趋势 ,2 0 0 2年 3月 ,安徽省某猪场发生一起以败血症、脑膜炎为特征的急性传染病 ,死亡率较高。笔者从该猪场采集病料 ,分离到 1株细菌 ,通过生化试验、动物接种试验等鉴定 ,证明分离菌为链球菌。1　临床症状病猪精神不振 ,食欲减少或废绝 ,体温 …     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的原核表达及其表达产物的免疫原性

根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌(HPS)D15基因鸟枪序列(登录号:NZ_ABKM01000005)设计1对特异性引物,以HPS5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增了D15基因。将其进行T-A克隆,构建pMD18D15质粒并进行序列测定和分析。结果表明,D15基因含有一个2418bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,与D15基因参考序列的同源性为99.9%。该HPSD15基因的推导氨基酸序列具有典型Omp85蛋白家族的拓扑结构特征。以pMD18D15质粒为模板,用PCR方法扩增HPSD15基因,并将其克隆到pET-28a(+)中,构建pETD15原核表达质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导重组菌,并用SDS-PAGE和Western-blot检测诱导物。结果表明,pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白的分子质量约为94ku,融合蛋白能被HPS阳性血清识别,提示该融合蛋白具有反应原性。昆明小鼠和豚鼠免疫试验结果表明,D15重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。     

表达副鸡禽杆菌外膜蛋白的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性研究

为构建表达副鸡禽杆菌外膜蛋白的重组乳酸乳球菌,本试验按照乳酸乳球菌表达的偏好性,优化合成副鸡禽杆菌外膜蛋白p9的编码碱基序列,将其接入表达载体pNZ8149的多克隆位点并导入食品级乳酸乳球菌NZ3900。将重组乳酸乳球菌灭活后经肌肉注射免疫SPF鸡,免疫后攻毒测定乳酸乳球菌的保护效果,检测血清中Ig G抗体和鼻黏膜sIgA抗体水平并检验免疫效果。PCR结果显示,成功构建了含p9片段的重组乳酸乳球菌,Western-blot检测显示,p9片段可在重组乳酸乳球菌内表达。重组菌最佳诱导表达条件:Nisin浓度为20 ng/m L、诱导时间为4 h。鸡肌肉注射免疫后可产生p9蛋白特异性的血清Ig G和鼻黏膜sIgA抗体。乳酸乳球菌重组疫苗免疫鸡对副鸡禽杆菌攻毒的保护率为60%~80%。结果表明,本研究成功构建了重组乳酸乳球菌pNZ8149-p9/NZ3900,该重组菌作为免疫原免疫鸡,对副鸡禽杆菌攻毒具有较好的免疫保护作用。     

猪链球菌2型噬菌体裂解酶催化域A5的关键氨基酸位点的鉴定

为了鉴定猪链球菌2型(Streptococcus suis 2)噬菌体裂解酶(Ly ACCG/Ly ACC)催化域A5的关键氨基酸位点,本研究利用NCBI、Pfam和Uniport数据库,对催化域A5的氨基酸序列中的各位点的保守性进行了比对分析;以噬菌体SMP基因组为模板,PCR扩增lyacc基因,测序分析后构建原核表达质粒p SJ2-lyacc;以质粒p SJ2-lyacc为模板,通过PCR扩增的方法将催化域A5中3个高度保守的氨基酸位点(30位的天冬氨酸/D30、53位的苏氨酸/T53和95位的甘氨酸/G95)的密码子分别定点突变为丙氨酸(A)的密码子,经测序确证后将突变体质粒p SJ2-lyacc/D30A、p SJ2-lyacc/T53A和p SJ2-lyacc/G95A分别转化BL21(DE3)感受态细胞,同时将质粒p SJ2-lyacc作为对照平行转化,用IPTG于27℃诱导表达,菌体重悬后超声裂解,上清液过滤,获得的蛋白粗提液经SDS-PAGE分析,表明重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的分子质量均约为30 ku;将重组裂解酶Ly ACC及其突变体D30A、T53A和G95A的蛋白粗提液用于平板裂解试验,结果显示,原核表达的重组Ly ACC的裂菌圈直径为2.2 cm;突变体G95A的裂菌圈直径仅为1.4 cm,裂菌活性部分降低;突变体D30A和T53A的裂菌圈消失,彻底失去裂菌活性。上述结果表明,D30和T53是Ly ACC的关键氨基酸位点。     

猪链球菌2型对红细胞的黏附及溶血作用

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)感染过程中对血液红细胞(RBC)损害及其机理,本研究采取无特定病原微生物感染的猪血液制备RBC悬液,根据预试验选用SS2∶RBC感染比(MOI)为100的SS2,分别体外感染RBC 0.5、1、1.5、2 h,光镜下观察BRC的形态变化;用G iem sa染色、CF D A-SE荧光标记检测SS2对红细胞的黏附和损伤,流式细胞仪分析不同作用时间的黏附率,real-time PCR检测SS2相关黏附因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、荚膜多糖(CPS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、纤连蛋白和纤维蛋白结合蛋白(FBPS)及溶血因子溶血素(Sly)的转录水平。结果显示,SS2感染后第0.5~1小时,其主要黏附RBC,细胞呈现棘突样病变,少量细胞肿胀,出现轻微溶血,黏附率分别为18.7%和46.3%;感染后第1.5小时,SS2不仅可以黏附RBC,且多数细胞溶血,RBC开始发生破裂,黏附率可达到91.7%;感染后第2小时,细胞几乎全部破裂。MRP和CPS2J转录水平在感染后第0.5~1小时增高,并与黏附率呈正相关,感染后第2小时表达水平下降;Sly转录水平在感染后第0.5~2小时持续增加,与溶血现象呈正相关;GAPDH和FBPS在感染过程中变化不显著(P0.05)。结果表明,SS2感染早期可对RBC产生黏附和溶血作用,先为黏附作用,后为溶血作用,且作用过程较快;主要参与黏附因子为MRP和CPS2J,溶血因子为Sly;GAPDH和FBPS是否参与SS2对RBC的黏附与溶血仍需证实;本试验结果为研究SS2传播和致病机制提供了重要的理论依据。     

猪链球菌2型的致病特性与毒力因子

介绍了猪链球菌2型对猪、人、其他动物及实验动物的致病特性;概述了猪链球菌溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外蛋白因子(EF)、溶血素、荚膜多糖、44kb蛋白和IgG结合蛋白及纤毛、粘着素等毒力因子的研究概况.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,共获得6株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3,并通过ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对6株单抗的特性和抗原表位进行分析鉴定。结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024～1∶2 048,腹水效价为1∶163 840～1∶204 800。3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3的亚型为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为κ型。Western-blotting和IFA结果表明6株单抗均能与重组Cap蛋白和PCV2产生特异性反应。相加ELISA结果显示,6株单抗可能识别不同的抗原表位。为准确鉴别不同单抗针对的抗原位点,以截短表达的重组Cap蛋白为抗原,进行Western-blot鉴定。结果显示,4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101～150aa,其余4株单抗可能针对1～50aa或者天然...     

猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性

2005年夏秋季从广东地区9例病猪中分离到2株猪源链球菌,均呈链球菌的特征形态,α溶血,生化试验结果相似,且都不与A~G链球菌群特异性血清发生凝集。经PCR及测序鉴定,一株为猪链球菌2型,另一株为猪链球菌9型。2型分离株的3个毒力基因均为阳性(sly+epf+mrp+),但对小鼠的毒力较低,2/10小鼠在接种细菌后第6~15 d发病致死,细菌在小鼠中的带菌时间至少15 d;9型分离株3个毒力因子均阴性(sly-epf-mrp-),但对小鼠有较强毒力,9/10小鼠在接种细菌后5 d内发病死亡,对小鼠的半数致死量为1.70×106CFU。表明广东地区致病性猪链球菌不仅存在2型,而且还有9型。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

细菌外膜蛋白的结构与功能

细菌外膜是典型、非对称性的磷脂双层结构,由脂质双层、微孔蛋白、脂蛋白、脂多糖组成,其主要成分为外膜蛋白（ＯＭＰ） 。现就ＯＭＰ 的结构、生理功能、免疫原性和致病作用机制进行论述     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16 S rDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型(1或/和2型)型特异基因序列设计了4条引物,建立了快速检测猪链球菌2型(1或/和2型)的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示,所建立的多重PCR方法特异、敏感,对组织中的猪链球菌2型(1或/和2型)的最低检出水平为30 CFU/mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测,并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证,结果显示,检出阳性符合率为100%,证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。