广西猪圆环病毒2型全基因组进化分析

为了调查近几年广西猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异趋势,为猪圆环病毒病(PCVD)的有效控制提供理论指导,对广西不同地区送检的病死保育猪肺及淋巴结样品进行PCV2检测和全基因扩增。应用Laser Gene 7.1和M EGA 4.1软件对PCV2全基因序列进行核苷酸同源性和遗传进化分析,并对开放阅读框(ORF2)氨基酸位点变异进行分析。结果显示,从阳性病料中成功扩增出12条PCV2全基因序列,其中6条PCV2序列属于PCV2d基因型,另外6条属于PCV2b基因型。不同基因型ORF2氨基酸序列分析显示,PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d各个基因型的ORF2氨基酸序列上的位点具有其独特性。本研究发现,近年来广西地区猪群PCV2d基因型的感染病例增多,有可能会替代PCV2b或者与PCV2b共同成为广西地区的主导基因型。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,共获得6株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3,并通过ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对6株单抗的特性和抗原表位进行分析鉴定。结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024～1∶2 048,腹水效价为1∶163 840～1∶204 800。3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3的亚型为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为κ型。Western-blotting和IFA结果表明6株单抗均能与重组Cap蛋白和PCV2产生特异性反应。相加ELISA结果显示,6株单抗可能识别不同的抗原表位。为准确鉴别不同单抗针对的抗原位点,以截短表达的重组Cap蛋白为抗原,进行Western-blot鉴定。结果显示,4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101～150aa,其余4株单抗可能针对1～50aa或者天然...     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。     

猪圆环病毒2型山东株全基因组的克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从山东疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,进行PCR扩增.回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-T-PCV2,并对筛选出的阳性质粒进行测序.结果表明,克隆得到的PCV2山东株的全基因组长为1 767 bp.应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中登录的国内外PCV毒株进行同源性比较.结果显示,PCV2山东株与国内外毒株的核苷酸同源性高达99.6%,推导的氨基酸同源性达95.4 %.进化树分析结果显示,PCV2山东株与GZ(EF515839)株同源性最高,表明,PCV2各分离毒株在进化方面存在地域上的相关性.     

猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采集自新疆沙湾地区某猪场的疑似仔猪多系统衰竭综合征病料猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组进行了扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,命名为XJ-SW1、XJ-SW2(Gen-Bank登录号:JN639856,JN639857)。经对阳性样品进行克隆、测定,并应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示,2株病毒的基因组全长均为1 768nt;XJ-SW1株与我国山东DE株(GenBank登录号:HM142897)的同源性最高(为97.91%);XJ-SW2株与韩国G2284株(GenBank登录号:JF317587)的同源性最高(为97.51%)。PCV2全基因组序列的进化分析表明,2株病毒为PCV2e基因亚型;对2株病毒与5个不同基因亚型的15株病毒的ORF2氨基酸序列进行比较,结果显示,XJ-SW1、XJ-SW2在ORF2的氨基端与PCV2d同源性较高,在羧基端与PCV2e同源性较高。表明,在新疆沙湾猪场流行的PCV2毒株为PCV2e,该毒株的ORF2存在一定变异。     

益于猪圆环病毒2型增殖的PK-15细胞系的克隆筛选与应用

通过有限稀释法对被猪圆环病毒2型(PCV2)感染的PK-15细胞进行2轮细胞克隆筛选,得到1株对PCV2高度易感且稳定的同源性PK-15细胞克隆株,以提高PCV2在PK-15细胞系中的感染效价。结果显示,利用间接免疫荧光试验(IFA)从成功获得的7株PK-15细胞克隆株中筛选得到3株荧光反应较强的PK-15细胞克隆株。通过IFA、半定量PCR和Western-blot等方法确定PCV2可以在PK-15细胞克隆株2中高效克隆并表达PCV2 Cap蛋白。QPCR结果表明,PCV2感染该PK-15细胞克隆株后第48小时病毒表达量达到最高。这证实,获得的高敏感性PK-15细胞克隆株2可用于持续产出高效价的PCV2以便于相关疫苗和诊断制剂的研制。     

益于猪圆环病毒2型增殖的PK-15细胞系的克隆筛选与应用

通过有限稀释法对被猪圆环病毒2型(PCV2)感染的PK-15细胞进行2轮细胞克隆筛选,得到1株对PCV2高度易感且稳定的同源性PK-15细胞克隆株,以提高PCV2在PK-15细胞系中的感染效价。结果显示,利用间接免疫荧光试验(IFA)从成功获得的7株PK-15细胞克隆株中筛选得到3株荧光反应较强的PK-15细胞克隆株。通过IFA、半定量PCR和Western-blotting等方法确定PCV2可以在PK-15细胞克隆株2中高效克隆并表达PCV2 Cap蛋白。QPCR结果表明,PCV2感染该PK-15细胞克隆株后第48小时病毒表达量达到最高。这证实,获得的高敏感性PK-15细胞克隆株2可用于持续产出高效价的PCV2以便于相关疫苗和诊断制剂的研制。     

猪圆环病毒2型ORF4基因编码蛋白的体外表达

为了探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF4基因结构及其所编码蛋白在PK15细胞中的表达特性,以PCV-2杭州株病毒DNA为模板进行PCR,结果扩增出了ORF4基因,并分别构建了pGEX-4T-1-ORF4原核表达载体和pEGFP-C2-ORF4真核表达载体.序列分析、SDS-PAGE分析和Western-blot检测表明,PCV-2 ORF4基因长180 bp,共编码60个氨基酸;其编码蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子质量大小约为6.685 ku.真核PK15细胞的转染试验显示,ORF4重组蛋白在PK15细胞的细胞核和细胞浆中均有表达,但对其有一定的毒性.     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2.将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在.证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性.     

湖南地区猪圆环病毒2型的分离与鉴定

为分离鉴定湖南地区2个猪场的猪圆环病毒2型(PCV2),从临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪体采集组织病料,验证为PCV2感染的病料,用无污染猪肾细胞系(PK15)细胞分离培养。采用间接免疫荧光试验(IFA)、分子克隆及生物信息学等方法对分离病毒进行分析。结果显示,分别获得了2株PCV2:1株为PCV2d(命名为ChenZ-2-1,GenBank号MH718995),另1株为PCV2b(命名为Yi Y-3-27,GenBank号KU317482),且两分离株的病毒效价TCID50分别为1×10~(5.66)/mL和1×10~(5.5)/mL。本研究有利于提高PCV2的诊断水平,对深入研究PCV2的发病机理及开发PCV2新型疫苗奠定基础。     

猪圆环病毒2型及猪细小病毒2型双重PCR检测方法的建立与应用

猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒2型(PPV2)均为猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的潜在致病病原。为了建立一种高效、快速、准确且能够同时鉴定PCV2和PPV2的双重PCR方法,下载GenBank已公布的多个PCV2及PPV2全基因序列并比对,针对PCV2和PPV2基因组的保守序列设计合成2对PCR引物,对双重PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PCV2和PPV2的双重PCR方法,并对其敏感性,特异性及与普通单一PCR的符合率做出评价。结果显示,该方法能同时扩增出666 bp(PCV2)与254 bp(PPV2)的特异性片段,对阳性标准质粒pMD-PCV2和pMD-PPV2的检测限分别为1.0×10²copies/μL和1.0×10¹copies/μL,对猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪细小病毒1/4/6/7型和猪圆环病毒3/4型的核酸扩增结果均为阴性。对临床疑似患PRDC的86份肺部组织样品进行检测,结果显示,PCV2阳性率为30.2%,PPV2阳性...     

Prohibitin 2基因参与猪圆环病毒2型PK-15细胞感染的研究

为探究Prohibitin2(PHB2)在PCV2感染细胞过程中发挥的作用,首先通过间接免疫荧光试验检测PCV2在PK-15细胞中的增殖变化,同时建立PHB2荧光定量PCR检测体系,然后以PCV2已知的宿主细胞互作蛋白gC1qR为对照,检测PCV2感染PK-15细胞后PHB2 mRNA的动态变化,最后鉴定PHB2 siRNA转染PK-15细胞中PCV2 Cap的表达。结果表明,PHB2在正常及PCV2感染的PK-15细胞中均有效表达。随着PCV2感染PK-15细胞,gC1qR转录水平在病毒感染3 h显著降低,感染6 h时升高,随后(12~48 hpi)转录水平下降;而PHB2转录水平在PCV2感染6 h内显著升高,随后(12~48 hpi)mRNA水平有所下降;RNA干扰PHB2对PCV2在PK-15细胞中复制起到显著的抑制作用。上述研究结果表明,PCV2可显著影响PK-15细胞中PHB2转录,而且PHB2对PCV2病毒复制具有调节作用。     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

广西断奶仔猪猪圆环病毒2型的检测

对广西 16个养猪场的 2 2份断奶仔猪病料用PCR技术检测猪圆环病毒 2型 (PCV 2 ) ,对阳性病料进一步检测猪瘟病毒、猪生殖和呼吸系统综合征病毒、伪狂犬病病毒及细菌性病原。结果 ,从南宁市郊某猪场表现衰弱症状的病猪病料中检测出PCV 2 ,而这些病料没有检出猪瘟病毒、猪生殖和呼吸系统综合征病毒、伪狂犬病病毒及可疑细菌 ,证实广西存在PCV 2引起的断奶仔猪多系统衰弱综合征 (PMWS)。     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位重组腺病毒的免疫保护性研究

为了评估联合表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因和具有免疫原性的T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE的免疫保护效果,将20头抗体和核酸均为阴性的断奶仔猪随机分为4组,包括2组免疫组、攻毒对照组和阴性对照组。2组免疫组分别免疫重组腺病毒rAd-ORF2-TCE和rAd-ORF2,2周后加强免疫1次,一免后第28天攻毒。通过PCV2特异性抗体水平的检测以及血清中和试验评估疫苗的体液免疫反应水平,通过外周血T淋巴细胞亚群的动态变化以及细胞因子分泌水平评估疫苗免疫诱导的细胞免疫反应水平。结果表明,与其他对照组比较,重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够诱导猪体产生更为强大的体液免疫和细胞免疫水平。攻毒试验结果表明,rAd-ORF2-TCE能够有效抵抗PCV2感染。本试验结果进一步证实了构建的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够有效地诱导猪产生足够的免疫保护能力。     

猪圆环病毒3型的分离与鉴定

为分离获得猪圆环病毒3型(PCV3),对疑似PCV感染死亡的仔猪病料进行PCR检测,将检测呈PCV3阳性的样品利用PK-15细胞进行病毒分离,同时利用原核表达的Cap蛋白制备多克隆抗体,通过IFA、免疫电镜和序列测定分析对分离株进行鉴定。结果显示,分离获得1株PCV3流行毒株,IFA检测有特异性荧光;电镜下可见圆形、直径约为20 nm的病毒粒子;与PCV1、PCV2的同源性分别为22.2%、22.1%,属于3a亚型,将其命名为LJ0603株。LJ0603株繁殖至第72小时病毒含量最高,且能稳定传代至第13代。PCV3 LJ0603株的获得为其结构功能和致病机制及免疫预防等研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型病毒样颗粒的制备及其免疫原性研究

利用真核细胞表达系统制备了猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白,旨在探索病毒样颗粒(VLPs)的形成及其免疫原性.以pCAGGS为表达载体构建了重组质粒pCAGGS-Cap-Flag,瞬时转染293T细胞,利用Flag标签对表达的Cap蛋白进行纯化.通过电镜观察重组Cap蛋白形成的VLPs形态表明,纯化的重组Cap...     

2008～2009年浙江省猪圆环病毒2型全基因组序列的比较和分析

应用PCR方法对2008～2009年采集的99份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的脾、肺、淋巴结混合组织样本进行猪圆环病毒2型(PCV2)检测,并以组织DNA为模板进行了PCV2的全基因组扩增,克隆后进行了测序。结果显示,2008年与2009年浙江省PCV2的平均阳性率为47.5%,与2004～2006年相比基本持平。随机选取18份阳性病料进行PCV2全基因组测序分析,结果,18个毒株均属于Group1,其中5个毒株(27.8%)属于1A分支,3个毒株(16.7%)属于1B分支,9个毒株(50%)属于1C分支。表明,Group1依然是浙江省PCV2的主导基因型,且1C分支从无到有,并逐渐占据主导地位。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。