死亡大鼠看家基因mRNA时序性降解的组织差异性研究

目的研究死亡大鼠看家基因mRNA时序性降解的组织差异性,评价其用于死亡时间推断的价值。方法SD大鼠20只分为死后0、1、3、5、7d共5组,脊椎脱臼法处死大鼠,提取大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织,在相应时间段提取RNA,应用一步法RT-PCR技术检测各组织中看家基因GAPDHmRNA和β-actinmRNA的水平,Vilber凝胶图像分析系统测定扩增产物IOD值,SPSS10．0统计软件对数据进行方差分析。结果GAPDHmRNA、β—actinmRNA扩增产物相对灰度与积分光密度值随死后经过时间的延长而逐渐减小,且与死亡时间显著相关,大鼠脾脏和脑组织GAPDHmRNA和β-actinmRNA在死后5d内可检出,心脏和肾脏在死后3d内可检出,而肝脏和肺脏GAPDHmRNA和β-actin mRNA降解较快,仅在死后1d内可检出。结论脑组织和脾脏中mRNA稳定性较好,适用于PMI特别是晚期PMI的推断。除环境温度外,环境湿度也是死亡时间推断中的重要影响因素。     

大鼠死后脑组织RNA降解与死亡时间推断的研究

目的探讨SD大鼠死后脑组织中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA、18s rRNA含量的比值与死亡时间(PMI)的关系。方法SD大鼠处死后分别置于15℃、20℃环境中,采用TRIzol试剂提取SD大鼠在死后即刻、1、2、3、5、7d时脑组织中的总RNA,采用RT-PCR方法与凝胶图像分析技术检测18s rRNA和GAPDH mRNA的含量,并将二者的比值(GAPDHmRNA/18s rRNA)与PMI进行统计学回归分析。结果SD大鼠死后脑组织中GAPDH mRNA在2d时降解不明显,但到3、5、7d时降解程度显著增加,且随着温度的升高,降解速度增加;而18S rRNA降解缓慢,直到7d仍无显著性降解变化,且降解速度几乎不受温度的影响。对GAPDHmRNA/18s rRNA值(Y)与PMI(X)进行回归相关分析:20℃时,Y=0.62-0.004X(R=-0.981,P<0.001);15℃时,Y=0.965-0.001X(R=-0.709,P<0.001)。结论SD大鼠死后脑组织中GAPDHmRNA和18s rRNA基因的相对稳定性即GAPDHmRNA/18s rRNA值与PMI存在明显相关性。     

实时RT-PCR检测大鼠死后管家基因mRNA的时序性降解

目的研究实时荧光定量RT—PCR方法检测死亡大鼠管家基因mRNA时序性降解的可行性,为死亡时间（Dostmortem interval,PMI）推断寻找新的研究手段。方法应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR技术．检测死后不同时间大鼠脑和脾中管家基因GAPDHmRNA及β—actinmRNA的水平,结果用循环阈值（简称Ct值）表示,分析死后经过时间与Ct值的线性关系,并建立死亡时间推断回归方程。结果GAPDH mRNA和β—actinmRNA的Ct值均与PMI之间存在显著的相关性。结论SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT—PCR在定量分析mRNA降解的研究中是一个较理想的技术手段。选用管家基因作为PMI推断的研究对象,可在法医检案中消除其他基因因为个体差异带来的误差,更具实用性。Ct值作为动态监测机体死后不同时间点的客观指标．与死后不同时间点的线性关系良好,推断死后经过时间尤其是晚期死亡时间较为理想。     

不同温度下大鼠脑组织RNA降解与早期PMI的相关性

目的探讨大鼠脑组织8种RNA指标,在不同温度下的表达水平与早期死亡时间(PMI)的相关性。方法将222只SD大鼠随机分为对照组(死后0 h)和4个实验组,实验组断颈处死后分别置于5℃、15℃、25℃和35℃的环境中,于死后1~24 h内9个时间点提取脑组织RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测8种RNA指标(β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9及mi RNA-125b)的表达水平,ge Norm软件选取合适内参,SPSS软件对内参标准化RNA指标进行回归分析,R软件构建推断PMI的数学模型,另选6只已知PMI的SD大鼠予以验证。结果 5S rRNA、miR-9和mi R-125b表达稳定,可作为内参指标。β-actin和GAPDH具有良好的时序性降解规律,在24 h内随PMI延长不断降解。R软件拟合得ΔCt值随PMI和温度变化的数学模型可用以推断PMI。运用β-actin和GAPDH验证模型的平均误差率分别为14.1%和22.2%。结论β-actin和GAPDH表达水平与PMI和环境温度相关性良好。本研究建立的数学模型可为温度变化条件下的早期PMI推断提供参考。     

小鼠死后脑RNA降解与死亡时间的相关性

目的 探讨小鼠死后不同时间和温度下脑组织β-actin mRNA、18S rRNA的降解规律与死亡时间的关系.方法 将24只健康成年C57BL/6小鼠随机分为2组,每组12只,断颈法处死后分别置于不同的环境温度中(4℃、37℃),恒定环境湿度为80%.分别于死后即刻和0.5、2、6、24、48h取小鼠脑组织进行总RNA...     

死亡大鼠组织中总RNA提取的质量控制及方法评价

目的探讨不同商品化试剂盒在提取组织总RNA过程中的优劣与适用范围,为实验室的质量控制提供依据。方法采用以膜提取技术为基础（SV total RNA isolation system）和以异硫氰酸胍/苯酚法为原理（TRIzol总RNA提取试剂盒）的两种试剂盒对死亡大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑组织进行总RNA的提取与评价鉴定,并使用琼脂糖变性凝胶电泳和2100芯片生物分析仪对提取的总RNA进行完整性鉴定和质量控制评价。结果两种商品化试剂盒提取的总RNA纯度与得率均可满足实验要求。各组织脏器中总RNA得率依次为脾脏＆gt;肝脏＆gt;肾脏＆gt;大脑＆gt;肺脏＆gt;心脏。结论与TRIzol总RNA提取试剂盒相比,SV Total RNA Isolation System提取时对操作人员熟练度要求较低,2100芯片生物分析仪有望替代凝胶电泳技术用于总RNA提取时的质量控制。     

大鼠死后管家基因mRNA稳定性及其时序性降解与PMI相关性研究

目的研究脑组织及骨骼肌内β-actin、GAPDH、RPL32、PKG1、SDHA、RPL13、HPRT、TBP、YWHAZ死后稳定性及其相对表达量与死亡时间(PMI)的相关性。方法取健康成年SD大鼠33只,依据据死亡时间不同随机分为11组(0h、1h、3h、6h、12h、24h、2d、4d、8d、16d、24d),分别在各时间点取大鼠胫骨前肌及脑组织约50mg,提取各组织总RNA,利用RT-q PCR技术检测9种管家基因的m RNA相对表达量。运用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件对基因稳定性进行评价,利用spss软件对内参标准化的m RNA指标进行回归分析。结果脑组织及骨骼肌中均为HPRT稳定性最高,适合用于本研究的内参基因。脑组织中SDHA、RPL32及TBP 3种指标的相对表达量变化与PMI有一定的线性关系。骨骼肌中m RNA指标相对表达量与PMI之间没有显著的相关性。结论脑组织及骨骼肌是较适宜推断晚期死亡时间的检材。脑组织中SDHA、RPL32及TBP 3种m RNA的相对表达量变化与PMI有一定的线性关系,有望成为推断PMI的辅助指标。     

大鼠死后脑、心肌和肾组织β-actin mRNA的降解与早期死亡时间的关系

目的 研究SD大鼠脑、心肌和肾组织细胞内β-actin mRNA的降解与早期死亡时间的关系,为早期死亡时间的推断寻找新的指标.方法 大鼠处死后置于20℃的环境中,分别于死后不同时间点提取脑、心肌、肾的总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测总RNA中β-actin mRNA的水平(Ct值),分析死后经过时间与Ct...     

根据mRNA稳定性推断死亡时间的研究

目的检测大鼠肺、胸肌β肌动蛋白(β-actin)mRNA在死后不同时间的表达,为死亡时间的推断寻找新的指标。方法大鼠断颈处死后于21℃温度控制系统模拟死后改变,在不同时间点抽提相应组织总RNA,利用RT-PCR技术检测β-actinmRNA的表达水平变化并对扩增产物进行半定量分析。结果大鼠肺β-actinmRNA于死后12d仍可检出,胸肌在死后8d的检测呈阴性。β-actinmRNA在肺脏和胸肌的稳定性呈现器官差异性和时间差异性。结论观察死后肺、胸肌β-actinmRNA的变化,可为死亡时间推断提供客观依据。     

死后不同时间大鼠心肌膈肌β肌动蛋白mRNA的检测

目的探讨死后不同时间心肌和膈肌β肌动蛋白mRNA(β-actin mRNA)的降解变化。方法大鼠断颈处死后置于21℃的温度控制系统,采用RT-PCR技术检测大鼠心肌和膈肌组织-βactin mRNA在死后即刻至12d的变化,并对电泳图像进行半定量分析。结果在死后即刻,以及保存2,4,6,8,10,12d的大鼠心肌组织样本中均可检测到β-actin mRNA,而膈肌组织仅在死后即刻和保存2,4,6d的样本中检测到-βactin mRNA;-βactin mRNA的扩增产物在死后12d内呈下降趋势。结论RT-PCR技术检测大鼠心肌和膈肌组织中的β-actin mRNA,其在死后12d内的降解呈现一定规律。     

不同死因大鼠心肌内多种RNA相对表达量变化与PMI的关系

目的观察不同死因下大鼠心肌内多种RNA相对表达量随死亡时间（PMI）的变化。方法建立断颈死、窒息死和失血性休克死大鼠模型,提取心肌中总RNA,利用实时荧光定量PCR技术检测甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde～3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）,β-肌动蛋白（β-actin）、诱导型-氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase。iNOS）、缺氧诱导因子-1（hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1）、肿瘤坏死因子-d（tumornecrosisfactor-d,TNF-a）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）tuRNA以及U6微核RNAfU6sreallnuclearRNA。U6snRNA）的循环阈值,观察各指标相对表达量随PMI的变化情况。结果U6snRNA表达稳定,可作为内对照。在死亡早期,CAPDH、HIF-1、iNOS、TNF-d和IL-6的相对表达量在窒息组和失血性休克组比断颈组呈现不同程度的增加,而β-actin在3个组皆呈现相对表达量下降趋势。在死亡晚期,随着RNA的不断降解,相对表达量持续下降。结论死后各RNA相对表达量的特征性变化可为不同死因下的PMI推断提供-定的参考。     

组织RNA检测用于死亡时间推断的研究进展

近几年来利用RNA的降解程度来推断死亡时间已逐渐成为法医学研究热点.本文复习相关研究文献,对大鼠不同组织(脑组织、心脏组织、肝脏组织和肾组织等)中RNA在推断死亡时间的具体应用方法做出总结,归纳出不同组织中的各类RNA在推断死亡时间方面的适用范围,以及对此种方法在推断死亡时间的过程中产生的问题及可行性的解决方法.     

The selection of endogenous genes in human postmortem tissues

Precisely determining the postmortem interval (PMI), which is crucial to criminal and forensic cases, is a research in which quantitative RT-PCR (also known as qRT-PCR or real-time RT-PCR) has been used to analyse gene expression levels and data normalisation should be required to eliminate the differences among the samples. Therefore, it is quite necessary to find stable molecular biological markers in PMI determination research. In this study, we compared nine commonly used endogenous markers (containing ACTB, GAPDH, B2M, U6, 18S rRNA, hsa-mir-1, hsa-mir-9, hsa-mir-194-1 and hsa-mir-203) in the 109 human tissue samples obtained from autopsy at the aim of finding stable markers in human tissues with consideration of the impact of parameters (PMI and cause of death). After RNA was extracted from four tissues (heart, brain, kidney, skin), the Ct values of nine endogenous markers were obtained by qRT-PCR and assessed by geNorm software. The results showed that U6, GAPDH and 18S rRNA were the suitable markers in our set of samples in various corpse conditions, that B2M and ACTB were reliable internal controls in heart tissue only, and that microRNAs had such high M values that they should not be chosen for endogenous control genes.     

大鼠死后视网膜细胞mRNA降解与死亡时间的关系研究

目的检测死后大鼠视网膜细胞mRNA的降解和死亡时间(PM I)的关系,为死亡时间推断提供新方法。方法应用复合荧光RT-PCR技术,检测死后不同时间(2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28h)大鼠视网膜细胞β-actin、Pgk1和Rp l 4 mRNA水平,以立即处死大鼠作为对照。方差检验比较组间差异,并对所得数据进行回归分析。结果死后28h内,大鼠视网膜细胞β-actin、Pgk1、Rp l 4 mRNA水平均随死亡时间的延长而下降。3个管家基因mRNA的降解与死亡时间的线性拟合回归方程分别为:Yβ-actin=-4436.205Xβ-actin+127581.7(r2=0.976),YPgk1=-1993.884XPgk1+57651.54(r2=0.973),YRp l 4=-1189.791XRp l 4+34533.46(r2=0.955)。结论大鼠死后视网膜细胞mRNA的含量随着死亡时间的延长而逐渐降解,与死亡时间具有相关性。     

兔皮肤钝器伤IL-1β、COX-2和MCP-1 mRNA表达与法医学应用

目的应用荧光定量PCR技术检测兔皮肤钝器伤后IL-1β、COX-2和MCP-1mRNA的时序性表达规律,分析其与损伤时间的关系。方法分别在兔耳皮肤钝器伤后<0.5h,0.5h,1h,2h,3h,4h,5h,6h,8h,12h,24h,1d,3d,7d和死后10min,0.5h,1h取材,一步法提取组织总RNA,逆转录合成cDNA第一条链,荧光定量PCR检测IL-1β、COX-2和MCP-1mRNA逆转录合成第一条cDNA链的拷贝数,作统计学分析。结果IL-1βmRNA在钝器伤后<0.5h表达显著增强(P<0.001),0.5h达到峰值,至第2d降至基本水平;COX-2mRNA于创伤后0.5h表达显著增强(P<0.05)并持续强表达至24h开始下降,第2d降至正常;MCP-1 mRNA在钝器伤后于1h表达显著增强(P<0.05),于3h出现表达峰,至第3d降至正常;3个指标在死后各时间组与正常对照无明显表达差异。结论检测皮肤IL-1β、COX-2和MCP-1mRNA可对早期损伤时间的推断提供帮助,并且这三个指标都可以鉴别生前伤和死后伤。     

用RT-PCR法区别生前与死后伤

12只SD大鼠随机分为生前伤、死后伤、麻醉伤和正常对照四组，损伤时间为15min，取创缘皮肤为检材；IL－6引物为寡聚核着酸引物（27hP），内对照引物为Tx基因（20hP），用TRIZOLTMTotalRNA提取试剂盒抽据总RNA，AMV逆转录酶使mRNA逆转录成cDNA，PCR扩增得出：在生前伤、麻醉伤以及正常皮肤中均能扩增出IL－6cDNA片段（590hp）和内对照Tx基因片段（188b），在死后伤组只能扩增出Tx基因片段；图像分析凝胶灰度扫描；生前损伤组与麻醉组无显著性差异，而二者与正常皮肤组有统计学差异。藉此，运用RT－PCR法可以准确区别大鼠实验性损伤的生前伤与死后伤。