动物细胞转瓶多层培养法

在动物疫苗生产中,需要大规模培养细胞以增殖病毒。目前,我国多采用10～15立升圆瓶旋转培养,不能满足日益增长的生产需要。影响转瓶细胞产量增加的主要原因是培养表面有限,一个10立升圆瓶培养表面约为2000平方厘米,15立升圆瓶培养表面约为3000平方厘米。增加细胞产量首先得增加培养表面。为此,我们设计并试验成功了以转瓶培养为基础,增加多层培养膜的转瓶多层培养法。     

PR8流感病毒突变株的制备及其在鸡胚上生长特性的研究

在前期发现流感病毒WSN株的NS2或NP蛋白突变使病毒在细胞上增殖能力明显提高的基础上,研究了这些突变是否会使PR8病毒效价在鸡胚上进一步提高的可行性,通过反向遗传操作技术获得了NS2E67S和NPP277A两株PR8突变病毒。经过比较突变病毒与野生病毒在鸡胚中的增殖能力,发现NS2E67S突变病毒在鸡胚上增殖后的效价与HA抗原表达量均明显提高,而NPP277A突变病毒在鸡胚上的增殖能力不及野生PR8病毒。该研究结果将对进一步研究病毒基因变异与宿主互作机制奠定基础,有可能通过NS2E67S突变病毒对改良流感疫苗具有重要的应用价值。     

猪流行性腹泻病毒细胞适应毒LJB-03株在三种Vero细胞上增殖效果的比较

为探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)细胞适应毒LJB-03株在3种Vero细胞上的增殖特性,分别以正常Vero细胞、适应无血清培养基的Vero细胞和稳定表达跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2)的Vero/TMPRSS2细胞(繁殖PEDV时无须添加胰酶)为宿主细胞,繁殖PEDV LJB-03株,观察这3种细胞接毒后的病变特点和病变时间,利用空斑法比较其增殖特性,并以间接免疫荧光和电镜技术鉴定病毒的增殖。结果表明,PEDV LJB-03株在正常Vero细胞和适应无血清培养基的Vero细胞上增殖时需添加的胰酶最佳质量浓度为7ug/m L;在这3种细胞上增殖时的最佳感染复数均为0.01;PEDV LJB-03株在3种细胞上效价达到峰值的时间均为36 h,其中在正常Vero细胞上病毒效价最高为7.17×10~7PFU/m L,在Vero/TMPRSS2细胞上病毒效价为3.33×10~7PFU/m L,在无血清Vero细胞上的病毒效价为2.85×10~7PFU/m L。综上所述,正常Vero细胞上PEDV LJB-03株的病毒效价可达其他2种细胞的2倍以上,但在培养病毒时正常Vero细胞需添加胰酶和血清,因此,适应无血清培养基的Vero细胞与Vero/TMPRSS2细胞在培养PEDV LJB-03株时更具有潜力。     

猪伪狂犬病病毒变异株感染绵羊胚胎鼻甲上皮细胞的病毒形态发生和细胞超微结构观察

应用超薄切片和透射电子显微镜技术,研究猪伪狂犬病病毒(PRV)MQ18变异株感染绵羊胚胎鼻甲上皮细胞(OFTu)的病毒形态发生和超微结构变化。结果显示:病毒在细胞核内复制、增殖,形成核内包涵体,装配好的病毒通过核内膜获得初始囊膜,以出芽方式出核进入细胞质,在高尔基体区域进行加工修饰、二次获得囊膜后形成完整病毒粒子,以包裹有病毒粒子的空泡与细胞膜相互融合方式,将病毒释放到细胞外;细胞超微结构主要表现为细胞质内空泡增多,线粒体增生、肿大,空泡样变,粗面内质网扩张,高尔基体形态异常,细胞核染色质浓缩、边集,最后细胞破坏、裂解,可见细胞早期凋亡及自噬小体结构。本研究结果为阐明PRV的感染和致病机制提供了理论依据。     

体外抗草鱼呼肠孤病毒药物筛选细胞模型的建立

以草鱼肾细胞系(CIK)和草鱼呼肠孤病毒为材料,采用噻唑蓝比色法分先给药后感染、先感染后给药、药物与病毒共孵育后感染3组进行抗草鱼呼肠孤病毒药物的筛选,建立了体外抗草鱼呼肠孤病毒药物筛选的细胞模型。先给药后感染试验组的结果表明,穿琥宁在阻断草鱼呼肠孤病毒吸附和侵入细胞时效果最强,其次是利巴韦林和板蓝根,黄芩的阻断效果最弱;而在先感染后给药试验组中,穿琥宁、利巴韦林和黄芩抑制草鱼呼肠孤病毒增殖的作用显著,板蓝根抑制病毒增殖的作用不明显;在药物与病毒共孵育后感染试验组中,利巴韦林对草鱼呼肠孤病毒有一定的直接杀灭作用,黄芩、板蓝根和穿琥宁等的体外杀病毒效果不明显。该模型的建立确认了药物在CIK细胞上具有抑制草鱼呼肠孤病毒的作用,不同给药方式药物的作用效果不同,也为抗病毒药物的筛选提供了有效的技术平台。     

新型鸭呼肠孤病毒TH11株在BHK21细胞系中的增殖特性

为研究新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)在BHK21细胞系中的增殖规律,将NDRV野毒株TH11接种BHK21细胞系,连续传代3次后,观察病毒对细胞的致病变效应(CPE),并对病毒核酸及其蛋白的表达和病毒增殖特性进行了鉴定。结果显示,NDRV TH11株能够在BHK21细胞中有效增殖,并产生以细胞巨融合为主的典型CPE,病毒蛋白在细胞中也获得了良好表达,并与σC蛋白特异性抗体发生反应。一步生长曲线显示,TH11毒株感染BHK21细胞后第0~12小时为潜伏期,第12小时开始增殖,第12~36小时进入快速增殖期,第48小时病毒效价即达到最高,即TCID50为106.57/0.1mL,随后病毒的增殖随细胞的崩解而降低。上述结果为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞灭活疫苗奠定了基础。     

山羊痘病毒感染的OFTu细胞的超微结构观察和宿主细胞中山羊痘病毒的形态学观察

用山羊痘病毒福建分离株GTPV-FZ株感染绵羊胚胎鼻甲(OFTu)细胞,制作超薄切片,透射电镜观察宿主细胞的超微结构和细胞中病毒形态的动态变化规律。结果显示,被感染细胞的超微结构表现为细胞质空泡增多,内质网扩张呈囊状且囊腔内充满絮状物,池内分离,可见细胞凋亡早期改变;线粒体增生、脊肿胀、变暗、模糊不清;高尔基体出芽;最后感染细胞被病毒破坏、溶解,可见残留病毒的包涵体。病毒粒子呈圆形或卵圆形,有囊膜,大小为250~350nm,可见两面凹陷呈哑铃形的核酸芯髓和2个侧小体结构。病毒在细胞质中复制、增殖,装配好的病毒以细胞膜出芽和细胞溶解方式释放病毒粒子。上述结果有助于全面认识山羊痘病毒的形态特征以及病毒与宿主细胞的相互作用。     

伪狂犬病病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞的增殖特性

体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,用伪狂犬病病毒感染骨髓间充质干细胞,通过细胞病变观察、毒力测定、PCR及间接免疫荧光试验,评估了伪狂犬病病毒在间充质干细胞内的增殖情况。结果显示,经体外分离培养并鉴定的间充质干细胞感染伪狂犬病病毒后,产生典型的细胞病变;经毒力测定细胞内伪狂犬病病毒的TCID50效价较高;经PCR从间充质干细胞内成功扩增出伪狂犬病病毒的特异性片段;间接免疫荧光试验显示间充质干细胞内分布有特异性荧光。表明,该细胞适应伪狂犬病病毒在其上增殖繁衍,具有作为伪狂犬病病毒致细胞病变机理、潜伏感染及致病等机制平台的潜质。     

BST2敲除的MDCK细胞构建及H9亚型禽流感病毒增殖效果的观察

为提高细胞培养系统中禽流感病毒的增殖效率,通过构建缺失BST2编码序列的MDCK细胞系,探索BST2对H9亚型禽流感病毒在细胞系中增殖的影响。利用CRISPR/Cas9系统对MDCK细胞BST2主要功能区域进行基因编辑,获得MDCK-BST2-KO单细胞克隆,并检测细胞的增殖能力。通过慢病毒表达转染获得BST2表达细胞系,检测接毒后不同细胞系的BST2蛋白表达情况,并比较病毒的增殖情况。结果表明,利用CRISPR/Cas9系统成功获得MDCK-BST2-KO单细胞克隆,该细胞克隆生长能力与母细胞无差异但增毒能力增强,且BST2蛋白抑制H9亚型禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖。     

口疮病毒GIF蛋白的原核表达及对小鼠免疫细胞的影响

探究口疮病毒GIF蛋白对小鼠骨髓源树突状细胞成熟及Na?ve CD4~+T细胞极化作用的影响。原核表达口疮病毒GIF蛋白,用纯化后的蛋白刺激小鼠树突状细胞,利用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况,ELISA方法检测细胞培养上清中细胞因子IL-12P40、TNF-α、IL-10、IL-1β的分泌情况。将Na?ve CD4~+T细胞与经不同质量浓度的GIF蛋白刺激后的树突状细胞共培养,用ELISA检测该树突状细胞对Na?ve CD4~+T细胞的免疫刺激能力,并进一步检测培养上清中IFN-γ和IL-5的分泌水平。结果显示,成功克隆了ORFV117基因,表达了羊口疮病毒GIF蛋白。经不同质量浓度蛋白刺激后,树突状细胞的表面共刺激分子CD86、CD40的表达水平均明显升高,其中5μg/mL蛋白刺激后,MHCⅡ表达水平显著升高,IL-12P40、TNF-α、IL-1β、IL-10释放水平显著升高。经不同质量浓度的GIF重组蛋白刺激后的树突状细胞对Na?ve CD4~+T细胞的刺激能力增强,淋巴细胞共培养上清中IFN-γ分泌量显著增加。这表明一定质量浓度的口疮病毒GIF蛋白能促进小鼠骨髓源树突状细胞的成熟,能够激活抗原递呈作用,并且具有刺激T细胞分化的能力。     

中国蓝舌病病毒血清5型毒株的分离与鉴定

为掌握我国云南省蓝舌病病毒(BTV)的流行情况,笔者在云南省师宗县设定哨兵动物,定期从哨兵动物上采集血液进行BTV分离。2012年笔者通过"鸡胚-C6/36细胞-BHK细胞"接种的方式从哨兵牛上分离出1株BTV(毒株号:V084/YN/2012),电镜观察显示,病毒粒子无囊膜,直径约80 nm,表面分布有纤突。血清中和试验表明,分离的病毒为蓝舌病病毒血清5型(BTV-5),使用抗BTV-5型的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光染色,进一步证实分离毒株为BTV-5型。设计特异性引物对V084/YN/2012毒株的Segment 2 (Seg-2)与Segment 3 (Seg-3)的ORF区进行RT-PCR扩增与克隆测序,序列分析结果显示,V084/YN/2012与BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)的Seg-2核酸序列相似度为95.4%,在系统发育树上聚为一簇,属Seg-2基因E型;Seg-3在系统发生树上属Eastern topotype型,与中国BTV-4型YTS4毒株聚为一簇,核酸序列相似度高达97.5%。病毒蚀斑与增殖曲线测定试验表明,V084/YN/2012与实验室保存的BTV-5型参考毒株(RSArrrr/05)在BHK21细胞上可形成形态大小相近的病毒蚀斑,二者在BHK21细胞上的增殖特性也基本一致。本研究确认了BTV-5型V084/YN/2012毒株在我国的分离,掌握了病毒Seg-2与Seg-3基因的遗传特征以及病毒在BHK21细胞上的增殖特性。研究结果为进一步开展中国BTV-5型的基因组测序、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒H基因过表达对病毒增殖的影响

为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T-PCR、荧光观察及W estern-blot分别在m RNA和蛋白水平检测H基因的表达。结果表明,H基因在CHS-20细胞内得到了表达。将p EGFP-C3-PPRV H重组质粒、空载体p EGFP-C3转染CHS-20细胞,待H基因表达后,接种PPRV Nigeria 75/1,病毒增殖一定时间后,以β-actin作为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR法研究病毒增殖量的变化。结果表明,相对于未转染及转染空载体p EGFP-C3的细胞,转染p EGFP-C3-PPRV H重组质粒的细胞PPRV增殖量得到了提高,且差异显著(P0.05),这说明在CHS-20细胞中过表达PPRV H基因能促进PPRV增殖。     

鸭病毒性肠炎病毒荧光实时定量PCR检测方法的建立和应用

根据已发表的鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因保守序列设计TaqMan探针,建立了检测 DEV的荧光实时定量PCR方法,用该法对DEV在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的增殖进行了检测。结果显示,DEV接种DEF 22 h后开始释放,第50 h病毒在细胞和上清中的含量增幅均为1×103 左右,病毒主要存在于细胞中,其含量是上清的1×102-1×103倍。     

传染性法氏囊病病毒在vero细胞上的适应增殖研究

传染性法氏囊病病毒在ｖｅｒｏ细胞上的适应增殖研究汪培林（四川省三台县畜牧局６２１１００）蔡宝祥李劲松（南京农业大学）鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）的许多毒株既能适应于鸡胚源细胞，也能适应于许多哺乳动物细胞，但不同毒株在哺乳动物细胞上的增殖特性有所不...     

猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定

从上海某猪场发病仔猪体内分离到 1株病毒 ,该毒株能在鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK2 1、ST、PK15细胞上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化 ,克隆毒株在BHK2 1细胞上的TCID50 为 5 0 μL 10 -6.68稀释液。该病毒能被伪狂犬病毒 (PRV )阳性血清中和。接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应。电镜观察可见直径 110～ 180nm的典型疱疹病毒粒子。用该病毒接种兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状。表明该分离毒株为PRV。     

应用电镜技术对猪瘟病毒的观察

应用电子显微镜技术早期观察猪瘟病毒,由于该病毒不能在体外增殖而受到了限制,另一方面,由于感染猪本身的组织和血清被其它病原体污染也妨碍了研究,Reagan和他的同事们在感染猪血清中发现病毒粒子为22～30nm(平均为27nm),Ageev在感染该病毒猪红细胞表面上和血清中检出直径为20～44nm球形粒子,经组织培养分离猪瘟病毒的早期报告为20～80nm,但以后对生长在组织培养物上的纯化了的猪瘟病毒报告是球形的,直径为37～67nm,并带有囊膜粒子,偶尔在病毒囊膜上石到呈不规则排列的纤突。     

猪瘟病毒免疫的细胞学研究进展

猪瘟 (Ｈｏｇｃｈｏｌｅｒａ ,ＨＣ或Ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ ,ＣＳＦ)是造成养猪业巨大经济损失的主要传染病之一。尽管在最近几年 ,由于分子生物学技术的发展和应用 ,对猪瘟病毒 (ＨＣＶ )的研究有了很大进步 ,但还存在着许多亟待解决的问题 ,如ＨＣＶ病毒粒子的结构、感染的分子基础、非结构蛋白的功能、病毒在细胞中增殖及其与宿主细胞的关系、免疫应答机制等。尤其在 2 0世纪70年代后期 ,出现猪瘟免疫失败的现象 ,使人们研究的重点开始转向对ＨＣＶ感染和免疫机制的研究。为此 ,本文将从ＨＣＶ在细胞中的增殖、病毒与…     

BHK细胞及其克隆细胞系对三株口蹄疫病毒敏感性的变化

试验发现,各实验室保存的BHK单层和悬浮细胞对三株口蹄疫病毒的敏感性是不同的。文中比较了各亲本细胞群及其克隆细胞系的敏感性。结果发现,所检查的细胞群都是由若干支持口蹄疫病毒增殖能力不同的细胞类型构成的,细胞群中敏感和非敏感细胞的相对数目是该细胞群中总敏感性的决定因素。     

口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒OLZ0 2株基因组序列为材料 ,采用Garnier Robson法、Chou Fasman法和Karplus Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构 ,用Kyte Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性 ,Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性 ,Jameson Wolf法预测了各蛋白的抗原指数 ,综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明 ,VP1蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多 ,是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原 ,但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位 ,有的甚至有可能成为优势抗原表位     

适合猪圆环病毒2型敏感复制的PK15细胞株的克隆与鉴定

为了有效提高猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中增殖的效价,采用有限稀释法将PK15细胞进行克隆,通过间接免疫荧光方法筛选对PCV2敏感的克隆细胞.结果表明,通过克隆后获得1株对PCV2高度易感的细胞PK15-B1,该细胞接种PCV2后培养3 d,病毒的TCID50达10-7.0/mL,病毒效价和生产速度明显高于...