藏獒源犬细小病毒的分离鉴定

为弄清犬细小病毒(CPV)在藏獒中的流行情况,将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠棉拭子8份处理后接种猫肾传代细胞(F81细胞),分离到6株病毒,对其进行了血凝试验(HA)、半数组织培养物感染剂量(TCID50)的测定,理化性质鉴定,提取分离株DNA并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其一特异性片段和VP2全序列,并与GenBank上登录的CPV毒株进行比对。结果表明,接毒后第6～13天在F81细胞上出现了明显的细胞病变(CPE),表现为细胞融合、变圆或拉长;所得分离株能使猪红细胞发生凝集反应,血凝效价为27～211;能抗酸(pH3)、热(60℃)、200mL/L乙醚、480mL/L氯仿;从细胞培养物中分别扩增出与特异性片段825bp一致以及与VP2全基因1 755bp一致的条带。将扩增的VP2序列与GenBank上登录的HQ883267.1、FJ222823.1、FJ005214.1等10个国内外CPV分离株的VP2序列进行比对;结果显示,与北京地区一分离株(HQ883267.1)的同源性最高,为99.0%～99.6%。所得分离株为不同毒株,但均为CPV-2a型。     

犬细小病毒免疫球蛋白对犬细小病毒中和活性的研究报告

犬细小病毒免疫球蛋白是治疗该病的主要药物。本研究针对静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白、多克隆抗体进行了血凝抑制试验比较,并在细胞上对其进行了蛋白毒性试验和中和活性试验等对比研究。结果发现,免疫球蛋白和高免血清多克隆抗体的血凝抑制价分别为1×211和1×210,它们稀释16倍以后对细胞无毒性作用,其中静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白的中和抗体效价为1∶873,明显优于多克隆抗体的中和效价(1∶426)。以上研究结果为静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白对犬细小病毒病的治疗提供了细胞学上的依据。     

犬细小病毒新疆株的分离与初步鉴定

犬细小病毒新疆株的分离与初步鉴定符子华，李淑霞，呼西旦，易中，胡尔玛西，王进成，刘军（新疆畜牧科学院兽医研究所乌鲁木齐８３００００）（乌鲁木齐动植物检疫局）犬细小病毒（Ｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＣＰＶ）是一种引起犬出血性肠炎或心肌炎的自主性细...     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析.结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/mL、3.5×103TCID50/mL、1.0×104...     

北极狐感染犬细小病毒的诊断

近年来 ,北极狐 (Alopexlagopus)养殖业在我国发展较快 ,经济效益很好。然而 ,部分养殖户饲养的北极狐由于感染犬细小病毒 (Canineparvovirus ,CPV)而大批死亡 ,造成严重的经济损失。CPV在自然条件下 ,主要感染犬 ,偶尔也感染貉、狐、狼等其他犬科动物。河北省乐亭县某村个体养殖户饲养北极狐 2 0 0 0多只 ,从 2 0 0 2年 8月开始 ,狐群出现精神沉郁 ,食欲减退 ,不愿运动 ,嘴肿胀 ,眼圈潮湿 ,呼吸困难 ,咳嗽 ,体温升高等症状。后期病情加重 ,机体消瘦 ,眼睛有脓性分泌物 ,发热 ,便血 ,最后衰竭而死。经尸体剖检、组织学病变观察、细菌培…     

犬细小病毒SH15株的分离鉴定与全基因组分析

为了解上海地区犬细小病毒的流行及其变异情况,从疑似犬细小病毒感染的死亡犬采集各种组织,无菌处理病料后同步接种F81细胞,盲传至第5代出现细胞病变,从肠组织中分离出1株病毒。采用电镜进行病毒形态学观察,以及HA、HI和PCR等方法鉴定病毒,结果证实为犬细小病毒,命名为CPV-SH15。该病毒的血凝效价为2~9,病毒TCID_(50)为10~(5.2)/m L,测得病毒编码区基因序列的全长为4 869 bp,与上海分离毒株CPV/CN/SH1/2013的同源性为99.8%,亲缘关系较近,说明上海地区的犬细小病毒的遗传变异并不明显。对其VP2基因的氨基酸序列进行分析,确定该细小病毒属于New CPV-2a亚型。该研究为犬细小病毒遗传进化的进一步研究奠定了基础,从而为犬细小病毒病疫苗的研制以及防控提供参考。     

犬细小病毒广西流行株的分离鉴定及生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒广西地方毒株的生物学特性,本研究收集广西各地疑似犬细小病毒(CPV)感染病犬的粪便通过接种F81细胞进行病毒的分离培养,并通过血凝试验、抗性分析、同源性分析和攻毒试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,接种3代后,细胞出现明显的病变(CPE),血凝效价为1∶512,第5代病毒的TCID_(50)为1×10~(-3.6)/0.1 m L,能抗热、酸、氯仿和乙醚;电镜观察到CPV为直径约25 nm圆形、无囊膜的结构,应用CPV特异性引物检测到长约1 419 bp和1 254 bp的特异性条带,提示成功分离到一株犬细小病毒毒株;测序分析结果表明,VP2基因与周边国家地区及我国各地方的参考毒株、流行株核苷酸同源性为98.9%~99.8%;系统进化发生分析表明,广西分离株的基因型为CPV-2a亚型,与泰国参考毒株VT148亲缘关系最近;与其它CPV-2a亚型相比,分离株的第267位、305位、324位和440位氨基酸位点发生了变异;动物回归试验结果表明,犬细小病毒广西分离株属于强毒株。本研究成功分离到犬细小病毒广西地方流行株,并对其主要衣壳蛋白VP2基因进行遗传变异分析,为更好的预防和控制犬细小病毒提供依据。     

犬圆环病毒及犬细小病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测犬圆环病毒(CanineCV)和犬细小病毒(CPV)的方法,根据CanineCV和CPV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增CanineCV和CPV的片段大小分别为984和668 bp。并将反应条件进行优化,建立了CanineCV和CPV的双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增CanineCV和CPV的目的条带,且未扩增出其他犬胃肠道病原;CanineCV和CPV的最低检出限分别为85.7和312 copies/L。对采集自广西地区的223份临床样品的检测结果显示,CanineCV的阳性率为2.24%(5/223)、CPV的阳性率为5.38%(12/223),后者与常规PCR检测方法相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于CanineCV和CPV的检测和流行病学调查。     

抗犬细小病毒单链抗体的制备

提取分泌犬细小病毒的杂交瘤细胞株3H9的总RNA,反转录获得c DNA链,并以此为模板扩增重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因,利用SOE PCR方法连接VH基因和VL基因,同时引入(Gly4Ser)3连接肽序列,扩增得到大小为765 bp的单链抗体(Sc Fv)基因。将Sc Fv基因连接至原核表达载体p ET-32a(+),构建成重组质粒p ET-32a-Sc Fv,转化至BL21(DE3)感受态细胞,并在37℃条件下进行IPTG诱导表达,得到融合蛋白。经SDS-PAGE分析大小约为46 ku,与预期结果相符。经Western-blotting鉴定,该蛋白能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别。间接ELISA试验以及中和试验结果表明,Sc Fv能够与犬细小病毒结合,具有中和犬细小病毒的活性。本试验成功构建了抗犬细小病毒单链抗体,并获得了高效表达。     

犬细小病毒人工感染狗的试验

自从Appel等人在1978年首次报道犬细小病毒(Canine Parvovirus,简称CPV)引起的犬出血性肠炎以来,这方面的研究工作进展较快,但关于细小病毒的发病机制至今仍不清楚。为了进一步研究、探讨CPV致病的发生规律,应建立相应的疾病模型,为此我们进行了本试验。 (一)材料与方法 1. 病料:采用具有典型CPV感染临床症状的病犬粪便及肠内容物。部分标本经密度梯度离心供电镜检查,其余标本置于-30℃冰箱中供人工感染用。 2.病料处理:取适量粪便及肠内容物标本,分别用pH7.4的PBS配成20％悬液。超声波350mA3分钟,然后3000rpm离心15分钟,弃沉淀,再8000rpm离心15分钟,取上清     

犬细小病毒兰州分离株VP2基因的克隆及进化树分析

本研究首次对地处西北地区的兰州的犬细小病毒分离株(命名为CPV/LZ-kbz11)进行了VP2基因克隆、测序,并与参考株、我国各地区流行株以及周边国家流行株进行了进化树分析和核苷酸同源性比较。结果显示,该毒株能在犬肾细胞系(MDCK)上成功生长,但不引起细胞病变。该分离株为CPV-2b亚型毒株,与M19296(CPV-2亚型参考毒株)、EU659118(CPV-2a亚型参考毒株)、EU145954(CPV-2b亚型参考毒株)、AB054224(CPV-2c亚型参考毒株)的核苷酸序列同源性分别为99.0%、99.3%、99.2%、99.2%;与我国及周边主要流行毒株EU213079(CPV-2a,浙江)、EF666059(CPV-2a,北京)、EF599096(CPV-2a,韩国)、EF592511(CPV-2a,台湾)、EU483512(CPV-2b,浙江)、FJ222821(CPV-2c,意大利)的核苷酸同源性分别为99.6%、99.5%、99.4%、99.4%、99.4%、99.4%。对VP2基因中非同义置换的氨基酸分析结果显示,兰州分离株与对比毒株的非同义突变位点共有4处,分别在第267位、324位、426位和440位的氨基酸处。     

犬细小病毒病基因工程疫苗的研究进展

从犬细小病毒病亚单位疫苗、表位疫苗、核酸疫苗、活载体疫苗等方面,论述了近年来国内外在犬细小病毒病新型疫苗研究方面的新进展,并对各种新型疫苗的优缺点及应用前景进行了讨论,为犬细小病毒病新型疫苗的研制提供理论基础。提出各种犬细小病毒病基因工程疫苗互有优劣,可以通过技术手段采用不同种类的新型疫苗的交叉组合、免疫原的集成使用等研制出更理想、更有效的疫苗。     

藏獒犬细小病毒感染诊疗

1999年 3～ 4月 ,兰州市某藏獒专业养殖户饲养的藏獒发生了一种以持续性呕吐、剧烈腹泻为主要特征的疫病 ,诊断为犬细小病毒感染。1　发病情况　　该专业户饲养藏獒 89只 ,包括公獒 5只 ,母獒 2 0只 ,6～ 12月龄后备繁殖母獒 8只 ,2～ 4月龄幼獒 31只 ,哺乳獒 2 5只。其中 8只后备繁殖母獒是 1999年 1～ 12月从青海、甘肃牧民处收购 ,运回后未隔离观察 ,也未免疫接种即入场饲养。该场由于圈舍不足 ,将幼獒混群饲养于一大院中 ,卫生条件较差。畜主准备待全部仔獒断乳后统一免疫接种。1999年 3月 2 5日 ,幼龄獒群中 3只发生呕吐、便血 ,经多方…     

MDCK细胞感染犬细小病毒后的差异表达谱分析

通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。     

中西医结合治疗犬细小病毒病

犬细小病毒病是由细小病毒引起的一种急性传染病 ,又称犬传染性胃肠炎。该病以出血性肠炎和非化脓性心肌炎为主要特征 ,2～ 4月龄幼犬的感染率最高 ,死亡率也很高。该病是继犬瘟热之后的犬的“第二杀手”。临床治疗多以西医方法为主 ,很少应用中兽医方法治疗。笔者在临床实践中应用中西医结合方法治疗犬细小病毒病 63例 ,疗效满意。1　临床症状1 .1　出血性肠炎　患病犬先呕吐 ,后腹泻。病初吐出食物或透明胃液 ,后呕吐次数增多 ,呕吐物多为黄绿色或咖啡色液体。发病 1d后 ,开始拉黄绿色稀便、血便或酱油色便 ,气味腥臭难闻。病犬精神萎靡 ,…     

犬细小病毒血凝抑制抗体和中和抗体的关系

对8份犬细小病毒免疫的犬血清同时进行中和(SN)抗体和血凝抑制(HI)抗体检测.结果,SN抗体和HI抗体具有正比线性关系,SN抗体近似于6倍HI抗体.其中HI抗体检测可在3 h内获得结果,操作简便,通过测定HI抗体效价即可推算出SN抗体的效价.     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒(CPV)VP2蛋白基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET-30a载体中,构建了原核表达载体pET-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白,Western-blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15.8 ng/孔,血清的最佳稀释倍数为1∶100,建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

犬呼肠孤病毒1型BJ-JB-3株的分离鉴定

从临床表现呼吸道症状的病犬血液中分离获得了1株病毒,采用细胞培养、血凝及血凝抑制试验、中和试验、免疫电镜观察、免疫荧光抗体试验进行了鉴定.结果显示,该病毒能使MDCK和Vero细胞产生明显的细胞病变(CPE),能凝集人O型红细胞和猪红细胞;能被呼肠孤病毒1型血清所中和,病毒粒子呈圆形,有实心和空心两种粒子,将感染细胞用抗呼肠孤病毒1型血清及荧光抗体染色后见明显的绿色荧光.表明,所分离的病毒为呼肠孤病毒1型.