链球菌猪主要致病种和型多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的链球菌属保守基因(EF-TU)、猪链球菌种保守基因(GDH)、C群马链球菌兽疫亚种保守基因(M-like)、猪链球菌型特异性基因(SS1型CPS1I、SS2型CPS2J、SS7型CPS7H和SS9型CPS9H)的序列设计合成7对引物,建立了一次性在属、种、型3个水平上检测链球菌猪主要致病种和型(C群马链球菌兽疫亚种和猪链球菌1、2、7、9型)的多重PCR方法。结果显示,该多重PCR在退火温度为61℃时可一次性扩增出7条符合预期大小、序列正确的基因条带;特异性试验和准确性试验结果均符合预期,无非特异性、交叉反应、假阳性、假阴性条带出现;对16株临床分离鉴定链球菌的检测结果与细菌学鉴定及单纯PCR鉴定的符合率均为100%;敏感性为0.08ng/μL;5次重复试验的结果也完全一致。结果表明,建立的多重PCR方法具有高度特异性、准确性、敏感性和稳定性,适用于猪场链球菌病的监控和流行病学快速诊断。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌 2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为 14 96bp目的片段的引物 ,建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌 2型参考株SS2 N株的检测结果为阳性 ,对马链球菌兽疫亚种 (C群 )参考株ATCC3 5 2 46、分离株SESZ Y、SESZ T、SESZ C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏菌的检测结果均为阴性 ;用EcoRⅠ内切酶进行酶切 ,获得了与预期结果一致的 863bp和 63 3bp的 2个片段。经对SS2 1株的PCR产物进行测序及序列分析 ,表明其与 193 3株、P1/ 7株的核苷酸同源性分别为 99.7%和 10 0 %。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

马链球菌兽疫亚种类M蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为建立简便实用的马链球菌兽疫亚种间接ELISA,对马链球菌兽疫亚种ATCC35246菌株的类M蛋白(SzP)进行了原核表达,以纯化的SzP作为包被抗原,建立了马链球菌兽疫亚种血清抗体间接ELISA,并对抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液的选择等反应条件进行了优化。结果显示,重组SzP的最佳包被浓度为0.625μg/mL,标准阳性血清的最佳稀释度为1∶40,最适封闭液为含50g/L脱脂奶粉的PBS溶液,待检血清的最佳孵育时间为60min,酶标二抗的最佳作用时间为45min。用建立的马链球菌兽疫亚种血清抗体间接ELISA对采自河南、山东、安徽、上海、江苏等地猪场的1 080份血清进行检测。结果显示,上述五地猪场血清样本马链球菌兽疫亚种抗体的阳性率分别为33.3%、16.5%、21.8%、13.9%和13.5%。上述结果表明,本试验建立的间接ELISA的特异性和重复性良好,具有重要的临床应用价值。     

黑豚鼠源链球菌的分离鉴定

为确定南宁市吴圩镇某黑豚鼠养殖场发生死亡的原因,从发病黑豚鼠眼分泌物、囊肿及肺中分离到可疑细菌,经形态观察、生理生化特性测定及16S rRNA序列分析,鉴定该分离菌为马链球菌兽疫亚种。经小白鼠回归试验证实,该分离菌可致死小白鼠。分离菌16S rRNA与马链球菌兽疫亚种(AB104843)的同源性最高,达99.8%。进化树分析显示,该分离菌与马链球菌兽疫亚种(AB104843)、马链球菌马亚种(JQ726495、JQ726496)的遗传关系最近,处于同一分支上。药敏试验显示,该分离菌对氨苄青霉素、氨曲南、头孢拉定、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢呋辛、链霉素、卡那霉素等高度敏感,对青霉素、亚胺培南、四环素、多西环素等不敏感。结果表明,马链球菌兽疫亚种16-58是南宁市吴圩镇某黑豚鼠养殖场豚鼠致死的病原菌。     

猪链球菌的分离与鉴定

猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的不同临诊类型传染病的总称。目前许多国家和地区都有猪链球菌病的报道 ,其中以E群链球菌引起的淋巴结脓肿最常见 ,以C群链球菌引起的败血症危害最严重。国内报道的动物链球菌病以L群兽疫链球菌为主 ,其次为D群和E群。近年来 ,猪链球菌病的流行呈明显上升趋势 ,2 0 0 2年 3月 ,安徽省某猪场发生一起以败血症、脑膜炎为特征的急性传染病 ,死亡率较高。笔者从该猪场采集病料 ,分离到 1株细菌 ,通过生化试验、动物接种试验等鉴定 ,证明分离菌为链球菌。1　临床症状病猪精神不振 ,食欲减少或废绝 ,体温 …     

猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16 S rDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型(1或/和2型)型特异基因序列设计了4条引物,建立了快速检测猪链球菌2型(1或/和2型)的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示,所建立的多重PCR方法特异、敏感,对组织中的猪链球菌2型(1或/和2型)的最低检出水平为30 CFU/mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测,并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证,结果显示,检出阳性符合率为100%,证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

罗非鱼源无乳链球菌双重PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中罗非鱼源无乳链球菌荚膜多糖的cpsF基因和CAMP因子的cfb基因序列,设计2对特异性引物,通过对反应体系和反应条件优化,并进行特异性试验、敏感性试验及人工感染罗非鱼组织样品检测,建立了快速检测无乳链球菌的双重PCR方法。结果显示,仅无乳链球菌能扩增出cpsF和cfb两条特异性条带,而海豚链球菌、金黄色葡萄球菌、鮰爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌无条带检出;经敏感性试验,最小模板检出量为7.632×10-2ng/μL;同时对30尾人工感染无乳链球菌的罗非鱼肝和肾组织中细菌DNA进行双重PCR检测和细菌分离鉴定,检出的阳性结果一致。证实,所建立的方法具有快速、特异、灵敏的优点,适用于对罗非鱼等无乳链球菌的感染病例进行流行病学监测。     

马链球菌马亚种新疆分离株的分离及耐药性和进化分析

为了解新疆马链球菌马亚种流行株的分子特性和遗传变异情况,对2017年采集的病马淋巴组织进行病原分离培养、生化鉴定和药敏试验,并对该分离菌株的SeM基因进行了PCR扩增和测序分析。同时,将该分离株与本实验室2013—2017年分离的10个分离株的SeM基因与国外分离株构建系统进化树。结果表明,成功分离鉴定了马链球菌马亚种ZZM17-1株,该菌株对阿莫西林、环丙沙星、克林霉素、多西环素、庆大霉素、左氧氟沙星、四环素、磺胺甲恶唑、利福平、诺氟沙星、土霉素、头孢噻呋、磺胺嘧啶钠和恩诺沙星等14种药物敏感,对青霉素和氨苄西林表现明显的耐药。基于SeM的系统进化树表明新疆地区马链球菌马亚种分离株分别属于Ⅰ群和Ⅳ群。该结果丰富了国内马链球菌马亚种的基因数据,为本地区开展马腺疫的防治提供了理论依据。     

猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性

2005年夏秋季从广东地区9例病猪中分离到2株猪源链球菌,均呈链球菌的特征形态,α溶血,生化试验结果相似,且都不与A~G链球菌群特异性血清发生凝集。经PCR及测序鉴定,一株为猪链球菌2型,另一株为猪链球菌9型。2型分离株的3个毒力基因均为阳性(sly+epf+mrp+),但对小鼠的毒力较低,2/10小鼠在接种细菌后第6~15 d发病致死,细菌在小鼠中的带菌时间至少15 d;9型分离株3个毒力因子均阴性(sly-epf-mrp-),但对小鼠有较强毒力,9/10小鼠在接种细菌后5 d内发病死亡,对小鼠的半数致死量为1.70×106CFU。表明广东地区致病性猪链球菌不仅存在2型,而且还有9型。     

猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速、灵敏的猪链球菌血清2型(SS2)LAMP检测方法,根据GenBank登录的SS2特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标,在其序列的保守区域设计LAMP引物,利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增,优化了LAMP的反应条件和反应体系,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果,利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增,扩增产物显色呈现阳性反应,电泳出现阶梯状条带,最低检测量为0.186fg/μL模板DNA,比常规PCR高1 000倍;且与其他常见的细菌无交叉反应。结果表明,建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点,适用于猪链球菌病的实验室快速检测。     

猪链球菌抗体GDH重组蛋白PPA-ELISA检测方法的建立

以纯化的猪链球菌重组谷氨酸脱氢酶(GDH)蛋白作为包被抗原,酶标葡萄球菌A(PPA)蛋白为二抗,建立了检测猪链球菌抗体的间接PPA-ELISA诊断方法。经方阵滴定确定了抗原的最适包被浓度为12.5mg/L,血清样品的最佳稀释倍数为1∶80,PPA-ELISA阳性反应的临界值为D450nm≥0.378,交叉反应试验结果表明,该重组抗原与其他常见的6种猪病的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复试验的变异系数均小于10%。经与武汉科前动物生物制品有限责任公司的商品化猪链球菌抗体检测试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;对320份血清进行猪链球菌抗体检测,阳性检出率为73.1%。试验证明,所建立的PPA-ELISA检测法重复性好、特异性强、灵敏度高,为大规模地进行猪链球菌病的流行病学调查和血清学诊断提供了有效的技术手段。     

马泰勒虫不同PCR检测方法的比较

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫PCR检测方法,用Bec-UF2、Equi-R;EMA-1F、EMA-1R两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的核蛋白体基因和表面蛋白基因进行了常规PCR方法检测,用EMA-5、EMA-6;EMA-7、EMA-8两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的表面蛋白基因进行了PCR和套式PCR方法检测。结果显示,以Bec-UF2、Equi-R为引物的PCR方法的阳性检出率为57.1%(32/56),以EMA-5、EMA-6;EMA-7、EMA-8为引物的套式PCR方法的阳性检出率为51.8%(29/56),以EMA-1F、EMA-1R为引物的PCR方法的阳性检出率为17.9%(10/56)。结果表明,以Bec-UF2、Equi-R为引物的常规PCR方法为检测马泰勒虫的最佳方法。     

四川省猪链球菌病的流行病学调查

2005年7月,在四川省资阳、内江等地相继发现一种以发病急、高热、伴有头痛等全身性中毒症状,严重者出现中毒性休克、脑膜炎为主要临床表现的病例。几乎所有病例与病死猪有关。在1个月内,共报告人感染204例,其中死亡38例,分布在以资阳、内江为主的12个市37个县。经确诊系由猪链球菌2型引起。在此期间,猪发病死亡647头,分布在8个市21个县。     

猪链球菌2型mrp基因ORF1序列的克隆及原核表达

根据猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白基因(mrp)的序列,设计并合成了1对特异性引物,以青海株的基因组DNA为模板扩增了mrp基因ORF1序列。将PCR产物进行了T/A克隆,转化大肠杆菌,鉴定成功获得目的片段后,将其定向亚克隆到pET-28a( )中,构建了原核表达质粒pET-28a-mrp,并将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经1 mmol/L IPTG诱导和SDS-PAGE分析,出现了与预期目的蛋白一致的外源蛋白带(27.0 ku)。Western-blot分析表明,该融合蛋白具有MRP的抗原表位。研究结果为今后开展该病的免疫学研究奠定了一定基础。     

用于检测仔猪致病菌的23S rRNA基因芯片的研制

以副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、肠道沙门氏菌、猪链球菌等12种仔猪致病菌为目标细菌,23SrRNA基因为靶基因,从GenBank中下载其23SrDNA全序列,在其变异区设计特异性探针,在保守区设计通用引物。通过序列分析、PCR靶标与探针杂交试验,建立了有13条寡核苷酸探针和2对通用引物的仔猪常见致病菌基因芯片检测方法。以参考菌株粗提基因组DNA的10倍系列稀释模板做PCR,扩增产物与探针杂交,检出芯片的灵敏度为100fg。对33个参考菌株用芯片检测,结果有1例不正确,只鉴定到属;在61个野外分离株中,55株的芯片检测结果与生化或测序结果一致,有6例不一致,符合率为90%。初步研究证明,该检测方法能快速、有效地鉴定多种仔猪常见致病菌,但要区分某些细菌的致病株与非致病株,还要检测毒力/毒素基因。     

利用随机扩增多态性DNA指纹技术对猪链球菌进行基因分型

通过优化反应条件和筛选随机引物 ,应用 10 0条随机引物对分离的 2 0株猪链球菌做随机扩增多态性DNA(RAPD)分型研究。结果表明 ,有 2 7条引物呈现良好的多态性和稳定性 ,可产生稳定、复杂的指纹图谱。采用SPSS10 .0软件分析了不同菌株之间的遗传距离 ,绘制出了菌株间的亲缘关系树状图 ,结果 ,2 0株猪链球菌被分为 4个聚类群