大鼠皮肤切创愈合过程中ICAM-1及P选择素的表达

目的　探讨细胞间粘附分子 1(ICAM 1)及P选择素的表达变化与损伤时间的关系。方法　应用免疫组织化学技术 ,对实验大鼠不同损伤时间的生前伤 ( 5min～ 7d)及死后伤 ( 5～ 3 0min)皮肤组织中ICAM 1及P选择素的表达变化进行观察。结果　在生前损伤组中 ,ICAM 1最早在伤后 1h ,最迟至伤后 3d在表皮层中呈阳性表达 ;P选择素最早在伤后 10min ,最迟至伤后 5h即在血管内皮细胞中呈阳性表达。此外 ,ICAM 1还在炎症细胞及纤维母细胞中表达 ,且随损伤时间变化而呈规律性变化。在时间段分组 ,ICAM 1在第Ⅰ组 ( 5min～ 1h)中阳性细胞率极低( 0 41± 0 73 % ) ,第Ⅱ组 ( 3h～ 7h)及第Ⅲ组 ( 9h～ 12h)均呈显著性增高 ( 9 79± 3 74% ,2 3 3 3± 1 10 % ) ,至第Ⅳ组 ( 1d)达高峰 ( 3 0 5 8± 2 65 % ) ,其后逐渐减少。ICAM 1及P选择素在死后伤中均呈阴性表达。结论　ICAM 1及P选择素可作为法医学损伤时间判定的有效指标。     

皮肤切创愈合过程中TLR2、TLR4表达及其法医学意义

目的探讨皮肤切创组织中单核-巨噬细胞TLR2和TLR4阳性表达与损伤时间的相关性,以寻找损伤时间推断的新方法。方法应用免疫组织化学技术研究45例不同损伤时间小鼠皮肤切创组织中TLR2、TLR4的表达情况,同时以3例正常小鼠皮肤组织作对照。结果皮肤切创组织中单核-巨噬细胞TLR2和TLR4阳性表达与损伤时间具有相关性。单核-巨噬细胞TLR2、TLR4阳性细胞比率(单核-巨噬细胞阳性细胞数与中性粒细胞、单核-巨噬细胞及成纤维细胞三种阳性细胞总数之比率)与损伤时间的回归方程分别为y=23.8099 0.9572x-0.0077x2 1.5×10-5x3(R2=0.872);y=25.2256 0.7893x-0.0059x2 1.0×10-5x3(R2=0.879)。结论TLR2、TLR4在小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区内单核-巨噬细胞阳性表达比率与损伤时间相关;检测损伤区单核-巨噬细胞TLR2、TLR4的表达可望成为推断损伤时间的新方法。     

在大鼠皮肤切创愈合过程中TGF-β_1基因及蛋白表达变化与损伤时间关系的实验研究

了解细胞因子在创伤及修复过程中的表达变化与损伤时间的关系。初步调查生前不同造创时间 ( 0 5h～16 8h)皮肤创缘组织在修复过程中TGF β1mRNA和蛋白质表达变化 ,并与死后伤 ( 0 5h～ 6h)上述变化进行比较。结果表明 ,在生前伤 ,TGF β1在上皮细胞的表达于损伤后 0 5h开始增强 ,以 2 4h～ 96h反应最强 ,除上皮细胞内表达外 ,还在肉芽组织的巨噬细胞和成纤维细胞表达。TGF β1的免疫印迹 (WesternBlot)分析表明 ,TGF β1蛋白表达的峰值在 16 8h ;TGF β1斑点杂交和原位杂交结果显示 ,mRNA的表达在伤后 3h开始 ,6h后明显 ,96h达峰值。死后损伤组在 0 5～ 3h内有免疫组化的弱～中度表达 ,但无mRNA的表达 ,3h后则均无任何表达。TGF β1在修复过程中的一些规律性变化及特点反映了与损伤时间的关系 ,可作为精确推断损伤时间的分子生物学标志。     

大鼠皮肤切创愈合过程中泛素的表达及其法医学意义

目的观察大鼠皮肤切创后泛素(ubiquitin)表达的变化规律。方法应用免疫组化方法,观察大鼠皮肤切创后1、3、6、12h和1、3、6、10、14d ubiquitin的表达情况,并用图像分析系统进行图像分析。结果正常对照组大鼠皮肤有低水平ubiquitin表达,切创后ubiquitin表达增加,伤后6d达峰值,伤后10d开始下降,伤后14d恢复到正常水平。结论ubiquitin可作为法医学损伤时间推断的有效指标。     

实时定量PCR检测大鼠脑挫伤后HIF-1α mRNA的表达

目的研究大鼠脑挫伤后挫伤部位脑组织HIF-1α mRNA的表达随损伤时间变化的规律及其在脑损伤时间推断中的应用。方法以Feeney法建立大鼠闭合性脑挫伤模型,应用实时荧光定量PCR技术检测脑挫伤部位HIF-1α mRNA的表达,采用2-△△Ct法比较实验组与对照组脑组织HIF-1α mRNA表达的倍数关系。结果与对照组相比,HIF-1α mRNA的表达在伤后1h即达到高峰,随后下降,伤后24h出现一次较小高峰,3～14d逐渐恢复至对照组水平。结论脑挫伤后HIF-1α mRNA的表达随损伤时间的变化呈现出一定规律性,可作为推断早期脑挫伤经过时间的生物学指标之一。     

RT-PCR检测不同时间大鼠皮肤切创TGF-β_1mRNA表达

目的 探讨TGF-β_1mRNA在不同时间的表达变化及其与伤后经过时间的关系。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别对大鼠生前0.5h、1h、3h、6h、12h、48h、72h、96h、168h和死后0.5h、1h、3h的皮肤切创组织中的TGF-β_1mRNA表达变化进行检测,采用ID软件对凝胶扫描的数据进行密度分析。结果 TGF-β_1mRNA在生前皮肤切创后0.5h上升,3h开始急剧升高,48h含量达到峰值;死后皮肤切创未见TGF-β_1mRNA的表达。结论 大鼠皮肤切创TGF-β_1mRNA的表达具有时间相关性,RT-PCR是检测细胞因子在基因水平表达的灵敏方法。     

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-9、-3表达的研究

目的研究caspase-9、-3在小鼠皮肤切创愈合过程中的表达及其变化规律。方法在小鼠背部正中制作皮肤全层切创模型,应用免疫组化染色技术观察切创及切创周边区内caspase-9、-3的表达情况,以无切创的小鼠皮肤作为对照。结果对照组中caspase-9、-3表达于表皮层,毛囊及皮脂腺。伤后3h损伤区及损伤周边区中可见少量多核粒细胞表达caspase-9、-3,6~24h,部分浸润的多核粒细胞和单核细胞caspase-9、-3阳性,此后caspase-9、-3阳性细胞逐渐以单核细胞和成纤维细胞为主。伤后caspase-9、-3阳性细胞率逐渐升高并在3d达到高峰,此后逐渐下降,至14d最低。结论caspase-9、-3可能引发正常小鼠皮肤表皮、毛囊和皮脂腺细胞的凋亡并参与正常皮肤细胞的自我更新;在小鼠皮肤切创愈合过程中,caspase-9、-3在多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞中表达,其时序性变化规律可望用于皮肤切创损伤时间的判定。     

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-8表达的研究

目的检测皮肤切创愈合过程中caspase-8的表达,探讨用caspase-8表达的规律推测皮肤损伤时间。方法建立小鼠皮肤切创模型,应用免疫组织化学技术和Western blot方法检测切创后不同时间皮肤中caspase-8的表达,以未切创小鼠皮肤组织作对照。结果伤后12~24h的损伤皮肤组织中部分单核细胞表达caspase-8。随伤后时间延长,caspase-8阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。结论伤后3~6h,caspase-8阳性细胞比率较低,12h后逐渐升高,3d达到高峰,以后逐渐下降。实验组中,1、3、5、7d组可见明显的caspase-8活化片段,位于分子量Marker44/42处。结论小鼠皮肤切创愈合过程中,caspase-8在损伤区单核细胞及成纤维细胞中表达,其时序性变化规律可望用于皮肤损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创愈合过程中磷酸化 p38MAPK 表达及其与时间的相关性

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的表达情况,以及不同损伤时间p-p38MAPK的变化规律。方法应用免疫组织化学和Westernblot的方法检测33例小鼠皮肤切创后各个时间段p-p38MAPK表达情况。结果正常组织中有少量的p-p38MAPK表达。伤后3～12h损伤区p-p38MAPK主要表达于中性粒细胞中,1～5dp-p38MAPK阳性表达主要为单核细胞和成纤维细胞。7～14dp-p38MAPK阳性表达主要以成纤维细胞为主。阳性细胞率3～12h逐渐升高,1d有所下降,3、5d阳性细胞率保持在高水平,7～14d阳性细胞率逐渐降低。Westernblot显示各个时间段均有p-p38MAPK的表达。其中12h和3d为2个p-p38MAPK含量的高峰。结论在小鼠切创愈合过程中p-p38MAPK在损伤区对诱导中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞的凋亡起重要的作用,同时p-p38MAPK的规律性表达可用于损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创后calpain1和calpain2的表达

目的观察小鼠皮肤切创愈合过程中calpain1和calpain2表达变化。方法应用免疫组织化学染色技术检测小鼠皮肤切创后calpain1和calpain2的表达。结果对照组的calpain1和calpain2均有表达,伤后1d calpain1阳性细胞率显著增加,达最大值。伤后3d阳性细胞比率显著下降。伤后5d阳性细胞比率再次显著增加,以后逐渐下降。伤后1d calpain2阳性细胞比率显著增加,伤后3d阳性细胞比率显著下降,达最低值。伤后5d阳性细胞比率再次显著增加,达最大值。伤后7d至10d,阳性细胞比率逐渐下降。结论小鼠皮肤切创后,calpain1和calpain2的表达随愈合时间而呈现双峰式变化。     

小鼠皮肤切创愈合过程中α7nAChR表达与损伤时间关系

目的检测皮肤切创愈合过程中α7nAChR的表达及其时间规律性变化。方法建立小鼠皮肤切创模型,应用免疫组织化学技术及Western blot方法检测切创后不同时间段皮肤中α7nAChR的表达。结果免疫组织化学结果显示,对照组α7nAChR表达于表皮、毛囊、皮脂腺、血管内皮及真皮中少数的成纤维细胞;伤后6～12h切创皮肤损伤区及周边区可见少量多核粒细胞和单核细胞表达α7nAChR,1～3d以单核细胞阳性表达为主,5～14d以成纤维细胞为主。α7nAChR阳性细胞率于伤后1d开始升高,伤后7d达最高峰,随后逐渐下降。经Western blot检测显示,对照组及各实验组均有α7nAChR阳性条带,其中伤后7d为α7nAChR表达高峰。结论α7nAChR在小鼠皮肤切创愈合过程中呈现一定的时序性变化。     

小鼠皮肤切创愈合过程中c-jun的表达

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区c-jun的表达及不同损伤时间c-jun的变化规律。方法应用免疫组织化学染色和Western印迹技术检测小鼠皮肤切创后各个时间段c-jun的表达变化情况。结果正常组织中有少量c-jun表达。伤后3～12h损伤区c-jun主要表达在中性粒细胞中,1～5dc-jun阳性细胞主要以单个核细胞和成纤维细胞为主,7～14dc-jun主要在成纤维细胞中表达。阳性细胞率3～12h逐渐增高,12h达高峰,1～5d有所下降,7d阳性细胞率达第二峰值,10～14d逐渐降低。Western印迹法检测显示各个时间段均有c-jun阳性条带,其中12h和7d为c-jun含量的2个高峰。结论小鼠皮肤切创愈合过程中c-jun在损伤区对诱导中性粒细胞、单个核细胞及成纤维细胞的凋亡可能起着重要作用,同时c-jun表达的规律性变化可用于损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创愈合过程中FAP和α-SMA的表达

目的观察小鼠皮肤切创愈合过程中成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein,FAP）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达的变化规律。方法应用免疫组织化学和West-ern印迹法检测小鼠皮肤切创后各个时间段FAP和α-SMA表达情况。结果免疫组化结果显示FAP与α-SMA在正常对照组及伤后1h组小鼠皮肤弱表达,伤后6h阳性细胞率开始升高,伤后5dFAP阳性细胞率达高峰,伤后3dα-SMA阳性细胞率达高峰,伤后14dFAP与α-SMA恢复至与对照组相同。Western印迹法检测显示FAP和α-SMA从1d起各个时间段均有表达,其中5d为FAP的表达高峰,3d为α-SMA的表达高峰。结论FAP可作为法医学皮肤切创形成时间的推断指标,α-SMA可作为损伤修复中后期的推断指标,FAP与α-SMA联合使用有望成为推断皮肤损伤时间的有效指标。     

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-6、-7表达的免疫组织化学研究

目的　观察皮肤切创损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内的表达及其变化规律。方法　应用免疫组织化学技术观察伤后不同时间小鼠皮肤切创组织中caspase 6、 7的表达 ,以非切创小鼠皮肤组织作对照。 结果　伤后 6h的损伤皮肤组织中可见少量多核粒细胞表达caspase 6、 7,伤后 12～ 2 4h ,大部分浸润的多核粒细胞及部分单核细胞为caspase 6、 7阳性。随伤后时间延长 ,caspase 6、 7阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。伤后 0～ 3h ,caspase 6、 7阳性细胞比率较低 ,12h后逐渐增加 ,伤后 3d达高峰 ,其后逐渐下降。 结论　小鼠皮肤损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内中性粒细胞 ,单核细胞及成纤维细胞中表达 ,其时序性变化规律可望用于皮肤损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创愈合过程中Ⅱ型大麻素受体的表达

目的观察皮肤切创愈合过程中CB2R表达变化的时问规律性。方法 健康小鼠50只,随机分为10组,建立皮肤切创模型,应用免疫组织化学技术及Westernbloting方法检测切创后不同时间段小鼠背部正中皮肤CB2R的表达。结果免疫组织化学结果显示,对照组CB2R表达于表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层、血管平滑肌、神经纤维外膜及神经纤维束束膜;伤后6h损伤区及周边区多核粒细胞少量表达CB2R,12～24h以单个核细胞阳性表达为主,3d以单个核细胞和梭形成纤维细胞表达为主,5～14d以梭形成纤维细胞为主。CB2R阳性细胞率于0h～3d逐渐升高,5d达最高峰,随后逐渐下降。经Westernblotting检测显示,对照及各个损伤时间段都有CB2R阳性条带,其中5d为CB2R表达高峰。结论小鼠皮肤切创愈合过程中,CB2R于损伤区及周边区多核粒细胞、单个核细胞、梭形成纤维细胞中表达,并具有规律性,提示CB2R可能参与皮肤损伤愈合,并可用于皮肤损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创愈合过程中p-JNK变化及其与时间的相关性

目的 探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区磷酸化JNK（p-JNK）的变化及不同损伤时间p-JNK的变化规律。方法 应用免疫组织化学和Westernblot方法检测小鼠皮肤切创后各个时间段p-JNK的变化情况。结果 正常组织中有少量p-JNK阳性着色。伤后3～12h损伤区p-JNK阳性着色主要在中性粒细胞,1～5dp-JNK阳性着色主要为单核细胞和成纤维细胞,7～14dp-JNK阳性着色以成纤维细胞为主。阳性细胞率3h～1d逐渐增高,1d达到峰值,3～5d有所下降,7d阳性细胞率达第二峰值。10～14d逐渐降低。Westernblot显示各个时间段均有p-JNK的阳性条带,其中12h和3d为p-JNK含量的2个高峰。结论 小鼠皮肤切创愈合过程中p-JNK在损伤区对诱导中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞的凋亡起非常重要的作用。同时P-JNK的规律性变化可用于损伤时间推断。     

小鼠皮肤切创IL-10和IL-4的表达及其与损伤时间关系

目的　探讨IL 10、IL 4在小鼠皮肤切创愈合过程中的表达变化规律及其与损伤时间的关系。方法　应用免疫组织化学及图像分析技术 ,观察实验小鼠不同时程的生前伤 ( 0 5～ 168h)及死后伤 ( 1～ 6h)皮肤创伤局部IL 10、IL 4的表达情况。结果　生前伤 ,IL 10在伤后 1～ 3h阳性反应逐渐增强 ,3h达峰值 ,2 4h降至较低水平 ,伤后 48h再次升高 ,72h又达新峰值 ,其阳性表达部位主要在表皮细胞及单核 /巨噬细胞 ;IL 4于伤后 2 4h出现明显阳性反应 ,96h表达水平达峰值 ,168h仍维持在较高水平 ,其阳性细胞主要为创伤局部的成纤维细胞。死后伤 ,IL 10仅于死后 1～ 3h呈阳性染色 ,IL 4未见阳性染色。结论　IL 10、IL 4在小鼠皮肤切创愈合过程中的表达呈现一定的时序性变化。     

小鼠皮肤切创愈合过程中M_3型乙酰胆碱受体的表达

目的 探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区M3受体的表达及其随时间的变化规律.方法 应用免疫组织化学染色和Western印迹技术检测小鼠皮肤切创后不同时间段M3受体的变化情况.结果 正常皮肤组织的表皮、毛囊、皮脂腺、汗腺、皮肌层等均表达M3受体.伤后6～12h,损伤区M3受体阳性细胞以多形核粒细胞为主;1～3d,M3受体阳性细胞以单个核细胞和成纤维细胞为主;5～14d,M3受体阳性细胞主要为成纤维细胞.阳性细胞率在伤后6～12h逐渐增高,12h达高峰,1～5d略有下降,但保持较高水平,7d阳性细胞率再次达到峰值,随后逐渐降低.通过Westem印迹法检测显示,各个时间段均有M3受体阳性条带,其中12h和7d为M3受体两个表达高峰.结论 多形核粒细胞、单个核细胞和成纤维细胞均表达M3受体,提示其可能在皮肤切创愈合过程中起重要的作用;M3受体表达的规律性变化可用于损伤时间的推断.     

小鼠皮肤切创后不同时间的Tenascin免疫组化染色变化

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中Tenascin表达变化及其与损伤时间的关系。方法制作小鼠背部全层皮肤切创模型,于伤后1、3、6、12h,1、3、6、9、12d分别观察切创周围皮肤、创缘皮肤及创腔肉芽组织的Tenascin免疫组化染色反应,并用图像分析技术检测Tenascin阳性染色的平均光密度,所得数据用SPSS for Windows 10.0软件包进行统计学分析。对照用无切创皮肤。结果对照组仅见真皮乳头、毛囊免疫组化染色弱阳性反应;伤后3h在切创周围的真皮乳头及毛囊Tenascin阳性染色增加;伤后12h明显增强,1~3d达最大值(0.336±0.061;0.282±0.017);伤后6d染色强度开始减弱,9~12d基本恢复正常。创缘皮肤及创腔肉芽组织伤后3~6h开始出现Tenascin阳性着色,12h明显增强,6d达最大值(0.410±0.051;0.460±0.027);伤后9d阳性着色开始减弱,12d基本恢复正常。结论小鼠皮肤切创愈合过程中产生的Tenascin随损伤时间呈现一定的规律性变化。     

大鼠骨骼肌挫伤愈合过程中caspase-3的表达及时间规律

目的观察大鼠骨骼肌挫伤愈合过程中,caspase-3的表达及其变化规律。方法制作大鼠右小腿骨骼肌挫伤模型,应用免疫组织化学法、Western blot法及caspase-3活性测定法对不同时间段大鼠骨骼肌挫伤后caspase-3表达进行检测。结果免疫组织化学及Western blot均显示,挫伤周边区caspase-3的活性随时间延长逐渐升高,5d时达最高峰,随后活性逐渐下降。免疫组织化学染色结果显示,伤后3～5d挫伤处坏死的骨骼肌细胞被清除干净,新形成的肌细胞大量增生,且新形成的肌细胞胞浆内有caspase-3表达;损伤后7～14d,新形成的肌细胞内仍然有caspase-3的阳性表达。结论大鼠骨骼肌挫伤后,挫伤周边骨骼肌表达caspase-3有一定的时间规律性,可望作为推断骨骼肌挫伤时间的指标之一;大鼠骨骼肌挫伤后,新形成的肌细胞表达caspase-3,提示caspase-3可能在骨骼肌分化过程中起重要作用。