三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立

为同步检测引起奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S rRNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4 m ol/L,Ba-16S rRNA为0.2 mol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102 copies/L,对Tg-529 bp达3×101 copies/L,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明该多重巢式PCR方法具有良好的敏感性和特异性。利用该方法对86份临床样品进行检测,结果显示新孢子虫阳性样品26份,布氏杆菌阳性样品2份,弓形虫阳性样品1份,其中新孢子虫和布氏杆菌均为阳性的样品1份,与单巢式PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重巢式PCR方法可以用来对致奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原进行快速、准确地检测。     

四种血清型胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌(APP)外膜蛋白OmlA序列设计种特异性引物,根据血清型1、2、6、7荚膜多糖(CPS)序列分别设计型特异性引物,通过优化PCR扩增条件,分别扩增出OmlA(952 bp)、CPS1(630bp)、CPS2(504 bp)、CPS6(720 bp)、CPS7(389 bp)特异性片段,建立了既可对APP进行定性检测又可对APP 1、2、6、7进行定型检测的多重PCR.特异性试验表明,此多重PCR能从APP 1～4、6～10标准株中扩增出与引物相应的特异性片段;对猪副嗜血杆菌、猪肺炎霉形体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增,均未扩增出片段.敏感性试验表明,此多重PCR能够检测到DNA的量为10 pg.45头疑似病猪病料的细菌分离鉴定结果与此多重PCR的鉴定结果一致.上述结果表明,建立的多重PCR适合于APP 1、2、6、7的鉴别诊断及流行病学调查.     

犬源环孢子虫PCR检测方法的建立

为了建立犬源环孢子虫的PCR检测方法,根据该环孢子虫18SrDNA基因序列,设计1对特异性引物;通过阳性参照摸索出该检测方法的最佳反应条件,进行了特异性和敏感性试验;并对临床样品进行了检测。结果显示,该PCR检测方法能特异性地扩增出犬源环孢子虫18SrDNA中379bp的片段,与牛源环孢子虫、柔嫩艾美耳球虫、人隐孢子虫、蓝氏贾第虫、刚第弓形虫、毛首线虫、大片吸虫、犬弓首蛔虫等8种虫体基因组DNA无交叉反应;最低能检测到84fg的阳性参照DNA,检测的157份临床样品中8份为阳性,比传统镜检方法多出3份。结果表明,建立的PCR检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于犬环孢子虫的临床检测。     

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列,设计了与PRV的 gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRV DNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549 bp(gB)、429 bp(gD)、366 bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重 PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重 PCR可以检测到 106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。     

五种禽呼吸道病病原多重PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)的基因序列,设计了5对特异性引物,建立了分别针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断方法,并进行了退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度的优化,以及特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明,设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG);建立的多重PCR方法具有较强的特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pgIBV的RNA和1pgILTV、10pgMG的DNA。对鸡临床样品的检测结果证明,该方法在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

二温式多重PCR同时检测鸡的6种呼吸道病病原方法建立

设计了6对分别针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、鸡毒霉形体(MG)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、新城疫病毒(NDV)和滑液霉形体(MS)的特异性引物,根据反转录聚合酶链反应(RT-PCR)原理和多重PCR原则,优化建立了一次PCR反应同时检测6种禽呼吸道病原的二温式多重PCR.该方法可同时扩增出6条区段大小与设计相符的特异性片段,即IBV 1720 bp、AIV 1050 bp、MG 732 bp、ILTV 647 bp、NDV 310 bp、MS 207 bp,对人工感染鸡临床样品检测结果证明,该方法可用于临床诊断.     

二温式多重PCR同时检测鸡的6种呼吸道病病原方法的建立

设计了 6对分别针对鸡传染性支气管炎病毒 (IBV )、禽流感病毒 (AIV)、鸡毒霉形体 (MG )、鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV )、新城疫病毒 (NDV)和滑液霉形体 (MS)的特异性引物 ,根据反转录聚合酶链反应 (RT PCR)原理和多重PCR原则 ,优化建立了一次PCR反应同时检测 6种禽呼吸道病原的二温式多重PCR。该方法可同时扩增出 6条区段大小与设计相符的特异性片段 ,即IBV 172 0bp、AIV 10 5 0bp、MG 73 2bp、ILTV 64 7bp、NDV 3 10bp、MS 2 0 7bp ,对人工感染鸡临床样品检测结果证明 ,该方法可用于临床诊断。     

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物,其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物,另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物,通过对多重RTPCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RTPCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对AIVH5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段;对AIVH7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段;对AIVH5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段;对其他AIVHA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段;对其他常见禽病病原扩增均为阴性;该多重RTPCR对AIVRNA、AIVH5和AIVH7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100pg。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒(NDV)基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示,强毒株可以扩增出442 bp的特异性片段和671 bp的通用片段,弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671 bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR,整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定,该方法最低能检测到100 pg的NDV RNA。     

应用三磷酸核苷水解酶基因检测弓形虫方法的建立

用Primer Explorer V4软件针对弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)基因设计了6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立弓形虫LAMP反应体系,并进行特异性和敏感性试验。结果显示,用该反应体系30 min即可检测出弓形虫NTPase基因,产生瀑布状的特异性条带,检测极限为20 copies,敏感性比PCR高10倍。与犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种和牛巴贝斯虫间无交叉反应,且重复性良好。应用此方法,可以在攻虫后第2天于试验猪血液中检测出弓形虫,比PCR方法提前2 d。表明将弓形虫NTPase基因作为环介导等温扩增检测弓形虫的目的基因,具有特异性强、敏感性高的特点,是快速诊断弓形虫病的一种新方法。     

羊泰勒虫中国株裂殖子的蛋白分析

采用SDSPAGE和Westernblotting试验对羊泰勒虫临潭株、隆德株、张家川株和夏河株裂殖子蛋白进行了分析。SDSPAGE结果显示,羊泰勒虫临潭株与隆德株的亲缘关系较近;张家川株与夏河株的亲缘关系也比较近。4个虫株的阳性血清分别与4个株裂殖子蛋白的Westernblotting试验结果表明,4个株虫体的阳性血清与临潭株和张家川株的裂殖子蛋白在38ku处有共同反应。提示38ku蛋白多肽有望成为特异性诊断抗原,为重组疫苗的研究提供依据。     

山羊和猪的肉孢子虫种类及其实验感染终末宿主的研究

在云南省家畜肉孢子虫调查中,发现当地山羊、猪各有2种肉孢子虫感染,即山羊犬肉孢子虫(Sarcocystis capracanis)、家山羊犬肉孢子虫(S.hircicanis)、猪人肉孢子虫(S.suihominis)、米氏肉孢子虫(S.miescheriana)。描述了各虫种的形态,并通过实验感染研究了各虫种的终末宿主。     

免疫酶组化法检测人工感染牦牛体内布氏杆菌的研究

为了确定免疫酶组化法检测布氏杆菌的临床应用价值,笔者利用甘肃省甘南州兽医站人工感染试验的牦牛,进行现场检测,并与传统的细菌分离培养法做对比试验。对每头牦牛20种组织器官的检验结果表明:免疫酶组化法对细菌分离培养法的阳性符合率为100％,但前者阳性检出率却显著地高于后者。并且用免疫酶组化法检测耗时短,操作安全、简便,因此更具有实用价值。     

东盟国家当前经济形势及前景

东盟国家为了对付经济衰退采取了一系列措施,并取得了一定成效。但是,同时也仍然存在着许多问题有待解决。由于国际和国内因素的影响,近期东盟国家经济将仅能实现低速增长。     

泰国政党制度向一党独大制过渡

2005年2月泰国的大选结果引起了许多人关注,泰爱泰党单独一个党赢得了议会的绝对多数,第一次组成了一党政府,在泰国政坛第一次形成了一党独大的局面。这是一种偶然现象吗?一党独大制能在泰国巩固下来吗?它对泰国的社会发展究竟起什么作用?本文试图就这些问题作一初步探讨。     

芽孢杆菌CY1-3株碱性纤维素酶基因celC的克隆及其在大肠杆菌中的表达

芽孢杆菌CY1-3株基因组DNA经Sau3AⅠ部分消化后回收2~7 kb片段,构建了部分文库。通过刚果红染色鉴定,筛选出6个纤维素酶基因的阳性克隆子,经酶切鉴定为同一克隆子,命名为pGJc-1。经测序分析,该片段包含一个由1 593个核苷酸组成的开放阅读框(ORF),命名为celC。经推导,celC基因编码由一531个氨基酸残基组成的CelC蛋白。氨基酸序列分析表明,CelC蛋白的氨基酸序列与多种细菌的-β1,4-内切葡聚糖酶具有很高的同源性。粗酶液的SDS-PAGE分析表明,celC基因在大肠杆菌中所表达的CelC蛋白具有纤维素酶活力,其分子质量约为58 ku。     

美国干涉与老挝1955年选举

根据1954年日内瓦会议协议,老挝于1955年将进行全民选举。美国将老挝视为在印度支那地区防范共产党势力发展的重要阵地。为使老挝新政府成为一个亲西方的反共政府,投入了大量的人力和物力。美国在将老挝纳入其冷战轨道的同时,也破坏了老挝的独立与发展。     

葡萄牙人在浙江沿海的通商与冲突

嘉靖元年(1522年)西草湾之战后,葡人被逐出广东,在中国私商的导引下,占据浙江双屿港作为国际走私贸易的据点。起初,葡萄牙人在双屿主要从事中国沿海的走私贸易,后发展成在日本、闽浙和满剌加之间从事三角贸易。随着走私贸易的发展,双屿形成了一个具有相当规模的葡萄牙人居留地。然而,由于葡人在浙江沿海从事海盗活动,以及中葡商人的“商欠”纠纷,促使中葡关系不断恶化,并导致中葡之间的大模武装冲突,其结果是葡萄牙人被逐出浙江沿海,结束了在那里的通商活动。     

近期马来西亚经济发展与外资变化

本文论述与分析亚洲金融危机后马来西亚的经济发展趋势和外资投资发展趋势的变化及其国际、亚太地区区域内、马来西亚国内的经济背景。     

蜜蜂白垩病的病原和防治技术研究

蜜蜂白垩病是西方蜜蜂( Apis mellifera L.) 的一种新的恶性传染病。从白垩病的蜜蜂幼虫尸体分离出病原菌蜂球囊菌( Ascosphaera apis) ,经光学显微镜观察,该菌的菌丝直径2 .0 ～3 .0 μm ,孢囊为黑色球状,直径40 .0 ～45 .0 μm ;孢囊内有许多孢子球,孢子球的直径9 .0 ～11 .0 μm ;孢子球又由许多孢子组成;孢子表面光滑,呈肾形或长椭圆形,大小2 .4 μm ×1 .2 μm ,孢子长与宽的比值为2 .0 。通过感染试验,确定了蜜蜂白垩病的病态发展过程以及蜜蜂幼虫的最易感染日龄。总结出影响该病的因素以及该病消长规律,提出了以防为主,防治结合的综合防制措施。