犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

猪IFN-γ mRNA TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测猪γ-干扰素(IFN-γ)的荧光定量RT-PCR方法,针对猪IFN-γ基因和管家基因cyclophilin A(CyPA)的核苷酸序列分别设计了特异性引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-IFN-γ和pMD18-T-CyPA为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建猪IFN一γ mRNA和CyPA的荧光定量RT-PCR标准曲线.结果表明,建立的方法在1×101～1×107copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数r2均高达0.999,扩增效率均高于99.0%;可检测至少为100 copies的阳性标准品.该方法具有快速、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可应用于临床样品的检测.     

猪生殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的PRRSV保守基因序列设计合成了引物和探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。同时用建立的检测方法对组织病料进行了检测,并与常规RT-PCR做了对比。结果显示,所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法灵敏度可达5.0×100拷贝/μL,比常规RT-PCR灵敏度高100倍。用该方法对东莞、增城、湛江等地的猪血清和多种组织样品进行了检测。结果,该方法与常规RT-PCR检测方法的阳性符合率为100%。用该方法对3份不同的组织样品进行了重复检测,结果表明,该方法具有良好的重复性,可满足当前PRRS的诊断需要。     

禽多瘤病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立检测禽多瘤病毒(avian polyomavirus,APV)的快速诊断方法,根据APV VP4基因的保守序列设计并合成引物和探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,验证了其特异性、敏感性和重复性,并利用建立的方法对采集的临床样本组织进行检测。结果显示,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1.0×10⁹～1.0×10²copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.021,检测下限为1.0×10¹copies/μL,与其他禽源病毒未发生交叉反应,重复性试验的变异系数均小于2%,重复性好,并且该方法在实际临床检测中可行。上述结果表明,建立的方法可用于禽多瘤病的早期诊断和APV快速检测。     

基于TaqMan探针的猪圆环病毒1型实时荧光定量 PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因,构建了重组质粒pMD-ORF2并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测PCV1的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的检测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL;对起始浓度为1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/μL标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%.表明,此方法具有良好的准确性和重现性.     

鸡毒支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、灵敏检测鸡毒支原体(MG)的方法,本研究根据GenBank中登录的MK984197.1,针对PAPV基因的保守序列设计了1对特异性引物探针,将PCR扩增后的PAPV基因克隆至pMD19-T载体,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒标准品,建立鸡毒支原体TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性等进行优化与验证。结果显示,C_t值与标准模板在0.53×10⁸～0.53×10³copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R²)为0.998,线性方程的斜率为-3.219,最低检测限度为0.53×10²copies/μL;经组内和组间重复试验,两者变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的稳定性和可重复性;与鸡滑液囊支原体(MS)、火鸡支原体(MM)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用所建立的MG-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法对部分地区抽检的60份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。上述结果表...     

猪脑心肌炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的检测方法,根据GenBank中EMCV 3D基因的保守序列设计并合成1对引物和1条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。该方法线性关系好,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数达到0.998;敏感性高,检测下限为10copies/μL,比普通PCR敏感100倍;特异性强,只有EMCV呈阳性,而与猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、BHK-21正常细胞均无交叉反应;重复性好,组内与组间的变异系数均小于1.5%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株人工感染小鼠的脑、心、脾中的病毒载量进行了检测,同时对临床采集的153份可疑病料进行了检测。结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于EMCV的检测及定量分析。     

猪流感病毒一步法荧光定量RT-PCR诊断方法的建立

为了建立一种在猪流感流行病学调查和临床诊断中应用的快速高效的诊断方法,根据猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)M基因的保守序列,设计并合成1对特异性引物和1条特异性TaqMan探针,建立了以RNA为反应模板的一步法荧光定量RT-PCR诊断方法。使用含有M基因的重组质粒作为标准品绘制标准曲线,该曲线效率值为2.014,误差值为0.005。试验结果表明,该方法灵敏度极高,最低可检测到10 copies的核酸;临床样品检测结果也显示其灵敏度高于普通PCR和病毒分离法;特异性强,对猪群常见的其他6种病毒检测结果均为阴性。临床样品检测显示,该方法操作简单,可以用RNA作为模板直接检测,节省时间,而且特异性好、灵敏度高,是可以应用于猪流感流行病学调查的一种可靠的诊断方法。     

美洲型与欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型经典毒株、高致病性变异毒株以及欧洲型毒株基因组的序列差异,设计2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株的多重荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.999以上;特异性强,只有PRRSV出现阳性反应,而与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性高,经典毒株、变异毒株、欧洲型毒株的检出下限分别为1.13、1.37、1.39copies/μL,均比普通RT-PCR敏感100倍;重复性好,组内及组间变异系数均小于1.5%。应用所建立的方法对采集的282份临床病料进行检测,结果 PRRSV阳性101份,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。结果表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可为PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

鸡传染性喉气管炎TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的快速诊断方法,基于ILTV g B基因设计特异性探针和引物,建立一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。结果显示,ILTV qPCR方法的标准曲线为y=-3.892 9x+44.607,线性相关值(R²)为0.998 8。该方法的最低检测限为1.0×10 copies/μL,批内与批间重复性检测的变异系数均小于5.64%,且与其他鸡源病原体无交叉反应。临床样本检测结果显示,该qPCR方法的检测阳性率为98.7%,而普通PCR的检测阳性率为92.61%。以上结果表明,该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于ILTV的疫病监测和流行病学调查,为ILTV感染的预防和诊断提供了有力工具。     

猪附红细胞体TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能定性与定量检测猪附红细胞体的方法,根据GenBank中猪附红细胞体的16SrRNA基因高度保守区设计了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了一种快速检测猪附红细胞体核酸载量的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法在107～101 copies/μL具有良好的线性关系(RSq=0.999)。能检测到模板的下限为30copies,灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。该检测方法与其他猪常见病病原体无交叉反应,具有良好的重复性。对临诊疑似猪附红细胞体感染猪血液进行了检测,其检出率比常规PCR方法高10%。表明该方法可用于临床上猪附红细胞体的检测及定量分析。     

禽呼肠孤病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立一种能够高效鉴别禽呼肠孤病毒（ARV）的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法,本研究根据NCBI数据库中ARV S1基因保守区的序列,设计了1对特异性检测引物和1条MGB探针,通过优化反应条件,建立了用于检测ARV的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法。结果显示,该方法特异性好,对鸡常见传染性疾病病原的检测结果均为阴性;灵敏度高,可以达到10 copies/μL;稳定性好,组间和组内试验的变异系数小。本研究首次建立了ARV TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法,该方法具有快速、简便和敏感性高等优点,为ARV的快速检测诊断提供了新的方法。     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒3型的双重荧光PCR方法的建立及应用

为建立同时检测牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛副流感病毒3型（BPIV3）的方法,通过对引物和探针筛选、反应体系和条件优化,成功建立了检测IBRV和BPIV3的双重荧光定量PCR方法。该方法只能特异性地检出IBRV和BPIV3,而对其他无关病原均不能检出;批内和批间变异系数均小于3%;对IBRV和BPIV3质粒标准品的检测下限分别为15.2 copies/μL和18.3 copies/μL。用建立的方法对采自四川、重庆、河北、安徽和吉林这5个地区的143份肉牛呼吸道疾病综合征(BRDC)样本以及四川省和青海省的59份牦牛BRDC样本进行检测,结果显示,肉牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为42.66%和39.86%,混感率为22.38%;牦牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为44.07%和30.51%,混感率为18.64%。上述结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有特异性和稳定性好、灵敏度高的特点,适用于临床上对IBRV和BPIV3的快速检测,临床样本的检测结果丰富了国内IBRV和BPIV3的流行病学资料。     

羊痘病毒实时荧光定量TaqMan PCR检测方法的建立

参照羊痘病毒(CaPV)P32的基因序列,设计合成了2套引物和1条探针,建立了实时荧光定量PCR技术,对细胞培养物、皮肤丘疹、痂皮等组织病料中的GPV进行了特异性检测和敏感性试验。结果显示,用300 nmol／L引物浓度和200 nmol／L探针浓度,获得的Cr值较小,而△Rn最大;可检测到相当于0．1 TCID50的病毒DNA;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0．999 5以上;组内和组间试验重复性的变异系数分别为2．3％和3．4％;与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,可同时检测大量样品等优点。表明。荧光TaqMan PCR是一种检测CaPV的良好方法,可对组织病料中低含量的CaPV或持续带毒宿主进行准确检测。     

猫细小病毒和猫疱疹病毒1型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时检测猫细小病毒（FPV）和猫疱疹病毒1型（FHV-1）的双重荧光定量PCR方法,针对FPV的VP2基因、FHV-1的UL21基因设计特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了双重荧光定量PCR方法,并绘制了标准曲线,其相关系数（R2）均为0.999,具有良好的线性关系。结果显示,FPV、FHV-1最低检测限分别为4.87和2.21 copies/μL;对猫的常见病毒及细菌均无非特异反应;批内、批间试验的变异系数均小于2%。证明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好。用建立的方法对178份样本进行检测,结果,FPV和FHV-1的阳性检出率分别为73.65%和16.85%,二者混感阳性率为15.73%,与临床确诊结果一致。上述结果表明,本研究建立的方法可用于FPV、FHV-1感染的早期诊断、定量检测和流行病学调查等。     

鸡γ-干扰素实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测鸡γ-干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)和鸡的28 SrRNA(Ch28 S)基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28 S的RNA,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28 S RNA作为内参进行一步法实时荧光定量RT-PCR,检测ChIFN-γ。结果表明:ChIFN-γ和内参Ch28 S的Ct值与标准品稀释梯度在1×102~1×107拷贝/μL范围分别呈良好的线性关系,r2均大于0.99。此方法用于检测ChIFN-γ,具有简便、高效、敏感、特异的特点。     

A型H1N1及H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型H1N1亚型流感病毒2009年北美变异株和H3N2亚型流行株的基因序列,设计了3套特异性引物、TaqMan探针,分别用不同的荧光基团标记,以构建的A型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组质粒作为阳性对照,经反应条件优化,特异性、敏感性和重复性试验,筛选出3套不同的反应体系及同一个反应参数,建立了可同时检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法。结果表明,该方法可特异地检测H1N1(人源、猪源)、H3N2(猪源),禽流感病毒H5、H9等A型流感病毒,且与新城疫病毒、减蛋综合征病毒等其他病毒不发生交叉反应,具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点,试验耗时仅3h。表明,建立的方法,一次试验即可完成A型流感病毒的初筛和H1N1、H3N2亚型流感病毒的初步确认定型。     

内蒙古绵羊梅迪-维斯纳病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种检测内蒙古地区绵羊梅迪-维斯纳病毒(MW)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据高度保守的gag基因序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件和反应体系的优化,建立了快速检测MW的TaqMan实时荧光定量PCR方法.结果显示,扩增相关系数为0.999,对重组标准质粒的最低检测量为1.0×100 copies/μ...     

鸡Akt基因mRNA SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为快速检测鸡细胞的增殖能力,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术,建立鸡Akt基因mRNA的定量分析方法。根据GenBank中原鸡Akt基因和鸡β-actin基因序列,设计合成特异性引物,应用RT-PCR技术从DF-1细胞中扩增出目的基因的DNA片段,并将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,构建重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin。分别以重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin为标准品建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测的标准曲线。结果显示,建立的RT-PCR标准曲线具有良好的线性关系和特异的单个峰,能够对样品进行稳定可靠的定量检测。采用本方法检测DF-1-PrP和DF-1-count细胞系的Akt基因的相对表达量,前者为1.656 9×103,后者为2.257 4×102,DF-1-PrP细胞系的Akt基因表达量明显高于DF-1-cont细胞系(P0.01),说明PrPC及Akt在DF-1细胞系中的表达量呈正相关。结果表明,本研究建立的鸡Akt RT-PCR检测方法能够通过对Akt基因的转录量进行检测而评价鸡细胞的增殖能力。