羊口疮病毒B2L截短重组蛋白刺激小鼠产生特异性抗体的研究

为研究羊口疮病毒(ORFV)新型亚单位疫苗,设计了ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白,命名为HBBH并经原核表达和鉴定。以不同剂量HBBH不加或加不同佐剂,经滴鼻或颈部皮下注射免疫BALB/c小鼠,其中滴鼻共4组(HBBH 10μg、20μg、30μg和20μg+LTB),注射组(HBBH 20μg+201佐剂)。同时设ORFV组织灭活抗原+201佐剂注射免疫对照和空白对照,每组共免疫3次,每次间隔7 d。HBBH间接ELISA检测一免、二免、三免后7 d以及三免后14 d血清中ORFV IgG、IgA和三免后14 d肺灌洗液sIgA的抗体水平,取不同水平的IgG ELISA阳性血清检测细胞中和抗体效价。结果显示,表达并鉴定了具有良好反应原性的包含ORFV B2L蛋白优势抗原表位的截短重组蛋白HBBH。免疫小鼠试验结果表明,不同剂量HBBH通过滴鼻或颈部皮下注射均可刺激小鼠产生ORFV特异性IgG抗体,20μg HBBH+201佐剂注射免疫能最大刺激小鼠血清IgG抗体的产生。实验小鼠三免后14 d肺灌洗液特异性sIgA仅在HBBH滴鼻免疫剂量≥20μg的三个组中检测到,其中30μg HBBH组刺激小鼠产生了最高水平的sIgA。在同为20μg HBBH滴鼻免疫时,添加LTB佐剂刺激小鼠产生了更高水平的sIgA。表明一定剂量的HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫可更好地刺激小鼠产生sIgA。HBBH间接ELISAIgG阳性血清的细胞中和抗体效价可高达1:128,且能中和4株ORFV分离株。结果表明,20μgHBBH+201佐剂注射免疫3次和20μg HBBH+LTB佐剂滴鼻免疫3次均能刺激BALB/c小鼠产生高水平的抗ORFV血清中和抗体IgG和黏膜抗体sIgA。本研究为ORFV B2L优势抗原表位截短重组蛋白作为亚单位疫苗提供了数据支持。     

鸡大肠杆菌病疫苗滴鼻与注射免疫方法的比较试验

目前国内鸡大肠杆菌病疫苗多使用鸡源大肠埃希氏菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｏ１，Ｏ２和Ｏ７８抗原提纯菌毛配以油佐剂或福氏佐剂制备，也有用鸡源大肠埃希氏菌Ｏ２，Ｏ７８和Ｏ３５抗原用甲醛灭活再加油佐剂或氢氧化铝佐剂制备。免疫途径多为鸡皮下和泄殖腔...     

免疫佐剂的作用机制及其应用

从抗原微粒化佐剂(如不溶性铝盐胶体、免疫刺激复合物、脂质体)、缓慢释放抗原佐剂(如油乳佐剂、抗原的微型包囊)、微生物佐剂(如细菌毒素、短小棒状杆菌菌苗、分枝杆菌及其成分、肽聚糖)、分子佐剂(如细胞因子、C3d分子、共刺激分子、超抗原、热休克蛋白、CpG序列)和其他佐剂(如维生素E、硒、抗生素类、拟胸腺素药物、蜂胶、中药多糖)等几方面阐述了免疫佐剂的性质、作用机制及应用的研究现状,为免疫佐剂的临床应用和进一步研制提供了参考资料。     

猪带绦虫六钩蚴45W-4BX抗原的制备及其杂交瘤细胞株的建立

为获得针对猪带绦虫六钩蚴(TSO)45W-4BX抗原的杂交瘤细胞株,用IPTG对TS045W-4BX的重组质粒pGEX-4BX进行了诱导表达,并采用Sepharose-4B层析技术对表达产物进行纯化,运用SDS-PAGE和Western-blot分别对其纯度和活性进行了检测.分别用弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂乳化已纯化的猪带绦虫TS045W-4BX重组抗原,随后用其分别免疫BALB/c小鼠3次,检测血清抗体效价呈阳性.之后,再进行加强免疫,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行融合,经TS045W-4BX抗原和GST抗原双系统间接ELISA筛选,最终获得了18株抗TS045W-4BX抗原的杂交瘤细胞株.采用有限稀释法对其中的4株进行5次亚克隆,最终获取了4株稳定分泌针对TS045W-4BX抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,金标试纸条法鉴定其抗体亚类均属于IgG1类,轻链为κ型.     

旋毛虫病免疫预防的研究——肌幼虫可溶性粗抗原对小鼠的免疫保护作用

本文用人工感染的方法获得大量纯净肌幼虫,经冻融、超声粉碎、高速离心制备出肌幼虫可溶性粗抗原,按不同剂量分别用弗氏完全佐剂、氢氧化铝佐剂及油性剂乳化后间隔1周分2～3次免疫小白鼠。最后一次免疫后1周攻击感染。攻击感染后7天查检肠道成虫估计成虫的生殖能力。攻击感染后5周剖检肌幼虫。结果弗氏完全佐剂、氢氧化铝佐剂及油性剂的作用近似。弗氏完全性剂组以0.3mg抗原诱导的免疫保护减虫率达65.71％;氢氧化铝佐剂组以0.6mg抗原诱导的免疫保护减虫率达71.7％;油佐剂组以0.3mg抗原诱导的减虫率最高达62.32％。     

金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖偶联抗原的制备及免疫原性分析

为建立金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)纯化与偶联技术方法,获得具有免疫原性的CP5偶联抗原,采用高压破碎菌体的方法释放荚膜多糖,酶处理去除核酸和蛋白质,通过离子交换层析进一步纯化,得到纯化的CP5,并对其纯度和反应原性进行检测;采用己二酸二酰肼(ADH)间桥法制备CP5-牛血清白蛋白(CP5-BSA)偶联抗原,加佐剂免疫小鼠,进行抗体水平测定。结果表明,纯化的CP5纯度为675.1g/kg,经用免疫琼脂双扩散试验检测,纯化多糖仅与同型菌株抗血清发生沉淀反应,偶联抗原CP5-BSA可以刺激小鼠产生CP5免疫应答。此研究结果为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的研制提供了试验依据。     

胞壁酰二肽类免疫调节剂

胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide,MDP)是分枝杆菌细胞骨架中具有免疫佐剂活性的最小结构单位,可以代替弗氏完全佐剂(FCA)中的整体分枝杆菌,促进机体对外源性抗原的特异性免疫反应。(一)生物活性和应用1.免疫调节作用:MDP在矿物油中能促进不同种属动物对抗原的免疫反应,口服水溶液就能促进抗体生成增加,增强天然疫苗和破伤风类毒素、绿脓杆菌类毒素、乙型肝炎表面抗原(HBSAg)和恶性疟原虫及人工抗原如HBSAg~(16)肽段等的免疫效果。MDP佐剂效力与FCA脂多糖(LPS)或氢氧化铝等相当或稍强。但大剂量多次给药可引起免疫抑制。     

基于抗原蛋白Fiber-2及细胞因子佐剂的Ⅰ群4型禽腺病毒亚单位疫苗的开发

为了开发一种抗I群4型禽腺病毒(FAd V-4)的亚单位疫苗,选择I群禽腺病毒血清4型流行毒株衣壳蛋白Fiber-2作为保护性抗原蛋白。利用昆虫细胞-杆状病毒系统生产Fiber-2蛋白,通过Westernblot检测重组蛋白的表达情况,利用双向琼脂扩散法检测重组Fiber-2的免疫原性。为了增强亚单位疫苗的免疫保护效果,添加鸡源白细胞介素2(chIL-2)和鸡源γ-干扰素(ch IFN-γ)作为免疫佐剂,与重组Fiber-2单独或混合使用,制备多种形式的亚单位疫苗,并进行动物攻毒保护试验。重组蛋白的Western-blot鉴定结果显示,63 ku处出现Fiber-2蛋白目的条带;双向琼脂扩散试验结果显示,重组蛋白效价达到1∶128,表现出良好的反应原性。动物攻毒保护试验结果显示,单独使用Fiber-2免疫SPF鸡,在50 μg/只的剂量下,可为SPF鸡提供100%的保护效果,以chIL-2和chIFN-γ为免疫佐剂,与重组Fiber-2联合免疫SPF鸡,可显著增强Fiber-2在低剂量(10 μg/只)下的免疫保护效果,上述结果表明重组Fiber-2联合chIL-2和chIFN-γ细胞因子佐剂所制备的亚单位疫苗在抗I群4型禽腺病毒感染领域具有良好的应用前景。     

鸡减蛋综合症灭活疫苗的研究──疫苗制造及免疫效力试验

用鸡减蛋综合症（EDS-76）BC127毒株接种9日龄鸭胚尿囊腔制备抗原，加福尔马林灭活后与油佐剂乳化成油佐剂甲醛灭活苗。三批疫苗实验室检验各项指标均合格，用其免疫105～140日龄未开产鸡，15～21天即可产生免疫抗体；用1／4剂量免疫21天后也能产生较强的免疫力。     

不同免疫刺激剂的安全性及免疫增强特性评价

本研究旨在评价不同免疫刺激剂的安全性及免疫增强特性,为后续亚单位疫苗的制备提供佐剂选择依据。本研究利用不同免疫刺激剂皮下免疫小鼠,免疫两次,间隔1周,最后1次免疫后的第7天处死小鼠,观察小鼠脏器大体病变;利用ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子的变化;取注射部位及主要脏器进行组织病理学观察。研究结果表明,免疫刺激剂壳聚糖和HMT13均引起促炎细胞因子IFN-γ显著增加,HMT13和ISA201会引起大量Ig G的产生;此外,壳聚糖刺激还可引起大量IL-17的分泌。本研究通过观察小鼠主要脏器及注射部位的大体和组织病理学变化以及检测小鼠血清中细胞因子的变化等方法评价了免疫刺激剂Alum、壳聚糖、α-半乳糖基神经酰胺、HMT13、ISA201的安全性及免疫增强特性,为后续亚单位疫苗佐剂的选择提供了数据支持及参考依据。     

多头绦虫抗原特性的研究——原头节及其排泄分泌抗原的免疫原性

应用多头蚴原头节可溶性抗原和将原头节进行体外短期培养后获得的排泄分泌（ＥＳ）抗原，以４ｇ／Ｌ抗原量与等体积的白油－司班佐剂乳化后，按每次２ｍＬ剂量对试验羔羊进行３次免疫。于最后一次免疫后２周，攻击感染２５００个多头绦虫虫卵，攻击后２２５ｄ剖杀各组羔羊。结果感染对照组羔羊全部感染了多头蚴，所含原头节为圆形或椭圆形，大小为０．３９０～０．４１０ｍｍ×０．３９５～０．４１５ｍｍ。原头节可溶性抗原及其ＥＳ抗原免疫组有２／３羔羊获全保护；１／３羔羊未能获保护，但其多头蚴包囊的大小、原头节数目及大小均小于感染对照组。     

氢氧化铝纳米颗粒对鸡新城疫抗原的免疫佐剂效应

以新城疫病毒为抗原,制备纳米氢氧化铝和常规氢氧化铝佐剂灭活疫苗,分别免疫20日龄雏鸡,比较了免疫后2～24 d的抗体效价和外周血淋巴细胞CD4、CD8分子mRNA的表达水平。结果显示,纳米氢氧化铝佐剂组抗体效价在免疫后第10 d达到峰值,为6.67±0.58,免疫保护期超过9 d,常规氢氧化铝佐剂组抗体效价在免疫后第10 d达到峰值,为4.33±0.58,免疫保护期小于7 d;与常规氢氧化铝佐剂组相比,纳米氢氧化铝佐剂组免疫后4～17 d的CD4以及10～17 d的CD8分子mRNA的表达水平显著提高,在峰值时后者的表达量为前者的2.0和1.9倍。结果表明,纳米氢氧化铝佐剂能辅佐鸡体产生比常规氢氧化铝佐剂更强烈的体液免疫和细胞免疫。     

牛O型A型口蹄疫双价灭活疫苗研究──—A型毒种的选择

收集保藏的６株口蹄疫（ＦＭＤ）Ａ型牛源强毒，适应乳鼠５代，转适８ＨＫ—２１细胞单层１０代，用弗氏完全佐剂制成疫苗免疫豚鼠。综合分析其对实验动物及制苗细胞的适应性、病毒感染性滴度、豚鼠抗强毒攻击的免疫原性、血清中和抗体应答的抗原广谱杜表明，在６株毒中ＡＦ／７２具有更好的适应性，病毒滴度高，免疫原性好，抗原谱广。     

家兔豆状囊尾蚴病的免疫预防

试验结果表明:利用超声波粉碎豆状带绦虫虫卵,将所得虫卵碎片悬浮液离心,取其上清液浓缩后作为抗原,加弗氏佐剂免疫家免,其保护率为79％。将豆状带绦虫虫卵在体外进行孵化,然后再将已激活的六钩蚴以皮下注射法免疫家兔,实验免获得抵抗力,其保护率为97.5％。豆状带绦虫虫卵经人工孵化后,以RPMI 1640培养基体外培养15天,然后将所得培养液离心,取其上清液透析、浓缩后作为抗原,加弗氏佐剂免疫家兔,其保护率为73％。     

甘油对油佐剂的稳定作用

1982年以来,发现甘油对冷冻保存的油佐剂疫苗有稳定作用。乳状液制备前于水相加入5～10％甘油,所制乳状液可以耐受冻融(有的反复冻融数次),稳定性不受影响。现将结果报告如下: 目前,我国油佐剂疫苗制造工艺尚不十分成熟,油佐剂不稳定问题还比较突出,有时出现疫苗抗原成分尚有效而乳状液破乳的情况,影响疫苗有效期。如果加入适量甘油以增加对冷冻稳定性,将疫苗冷冻保存,则油佐剂在冷冻期间老化过程基本停止,直到出厂化冻才重新开始,这对疫苗的检验、保存、出厂使用都是有利的。     

口蹄疫超免疫血清的制备

超免疫血清 (ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅｓｅｒｕｍ )是一种含有高效价特异性抗体的动物血清。口蹄疫 (ＦＭＤ)超免疫血清是采用口蹄疫病毒(ＦＭＤＶ)佐剂抗原作免疫原 ,通过逐次增大抗原含量多次免疫豚鼠 ,使豚鼠不断产生免疫应答 ,从而获得抗ＦＭＤＶ的高效价特异性抗体血清。该血清主要用于ＦＭＤ的中和试验、补体结合试验 ,也可用来生产诊断制剂 ,用于ＦＭＤＶ型的鉴定及易感动物的被动免疫。　　我们通过试验 ,以ＦＭＤＶ和弗氏不完全佐剂制备抗原结合物免疫豚鼠 ,定期采血 ,用补体结合试验监测抗体水平 ,使ＦＭＤ超免疫血清效价达到 1∶1…     

猪流行性腹泻病毒重组S1蛋白的免疫原性评价

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株S1基因经密码子优化后克隆到慢病毒表达载体,在293T细胞包装PEDV S1重组慢病毒;重组慢病毒感染293T细胞,经有限稀释法筛选获得高效稳定表达S1蛋白的重组细胞系HEK-293T-S1;生产、纯化S1蛋白,添加佐剂制备成重组S1亚单位疫苗,经肌肉注射免疫实验用巴马小型猪,评价...     

鹦鹉热衣原体亚单位疫苗免疫原性及免疫保护性研究

本研究将鹦鹉热衣原体的MOMP基因经PCR扩增后与pET-22b(+)载体连接构建重组质粒,转化入E.coli,通过IPTG诱导表达MOMP蛋白,鉴定重组蛋白的表达和反应性。结果显示,重组蛋白被成功表达,分子质量大小为40 ku,经溶解、透析纯化后,重组MOMP蛋白纯度为91%,能与鼠抗重组MOMP蛋白抗体产生特异性反应,与鹦鹉热衣原体阳性血清呈强阳性反应。重组MOMP蛋白与ISA201佐剂乳化制成鹦鹉热衣原体亚单位疫苗,免疫绵羊后抗体效价高达1∶4 222,用强毒株攻毒后保护率达100%,表明此鹦鹉热衣原体亚单位疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性。     

副猪嗜血杆菌聚胺转运蛋白PotD重组亚单位疫苗的制备及其免疫保护效力的评价

为研究副猪嗜血杆菌Pot D蛋白的免疫保护效力,本研究以副猪嗜血杆菌SC1401菌株的基因组DNA为模板,PCR扩增去除信号肽编码序列后的potD基因部分片段,将其克隆于pET-28a(+)载体中,构建重组表达质粒pET-potD,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,超声破碎后SDS-PAGE分析目的蛋白表达形式。纯化后的蛋白以每只50 g的剂量免疫2周龄的BALB/c小鼠,同时设置SC1401全菌灭活疫苗组、生理盐水对照组及佐剂对照组,一免后第14天进行一次加强免疫,二免后第14天断尾采血进行抗体效价测定,并以5×LD50的SC1401野毒株攻毒,评价其免疫保护效力。结果显示,目的蛋白的分子质量为44.3 ku,主要以包含体形式存在;ELISA测定的Pot D蛋白的血清抗体效价(最高稀释度为1∶20 000,P/N2.1),显著高于SC1401全菌甲醛灭活苗(最高稀释度1∶10 000)、生理盐水对照组及佐剂对照组的血清抗体效价(P0.05)。攻毒后显示Pot D蛋白组的保护力达80%,与SC1401全菌灭活疫苗组持平,远高于生理盐水对照组及佐剂对照组。结果表明,Pot D重组蛋白能够很好的激发小鼠体内的免疫应答,提供较好的免疫保护力,可以作为副猪嗜血杆菌病重组亚单位疫苗的候选抗原蛋白。     

分泌型表达EDA-EmIMP1的重组枯草芽胞杆菌的构建及其免疫原性研究

枯草芽胞杆菌有着异源蛋白表达系统,纤维连接蛋白外域A(EDA)是一种能够提高相关蛋白的抗原性的佐剂,为了增强巨型艾美耳球虫的免疫相关蛋白1(IMP1)的抗原性,笔者对枯草芽胞杆菌分泌表达载体作为EDA分子佐剂重组亚单位疫苗的递呈载体的功能进行了研究,构建质粒pHT43-EDA-EmIMP1和pHT43-EmIMP1,将获得的重组质粒转化到枯草芽胞杆菌感受态中。将该重组菌对鸡饲喂,进行免疫学试验并做免疫效果评价。结果显示,该重组枯草芽胞杆菌可以成功表达目的蛋白,蛋白大小为70 ku。ELISA检测EDA组的效价最高,其滴度在3 200左右;三免EDA组的IFN-γ浓度显著高于其他组(P0.05);三免EDA组和EmIMP1组的IL-12/70浓度显著高于PBS组(P0.05);CD4+T细胞群的检测显示,EDA组的CD4+T细胞群比例显著高于枯草芽胞杆菌组和PBS组(P0.05);EDA组、枯草芽胞杆菌组和EmIMP1组的卵囊排出量都显著低于攻虫组(P0.05);病变计分可以看出,EDA组对肠道保护效果显著优于除空白组外的其他组(P0.05)。以上各项免疫学指标表明,枯草芽胞杆菌分泌型表达载体作为EmIMP1的抗原递呈载体可以有效提高免疫原性,其中EDA佐剂组的免疫效果最好。