免疫酶技术证实:国内的猪传染性胃肠炎病毒与比利时的CLV在血清学上相一致

1979年黄均健等用免疫荧光、中和试验、酶免疫试验和猪体交互保护试验等发现国内猪传染性胃肠炎病毒(简称TGE华株)与国外TGE M株、SH株和TO株不同,初步认为TGE华株可能是TGE新的血清型,但也不排除是一个新的冠状病毒的可能。M.Pensaert在1978年报道比利时发现一个与TGE不同的CLV(Corana-like virus)。我们用比利时的CLV抗血清制成的酶标记抗体染上了我国的TGE华株。现报告如下。     

兔出血症病毒保存及传代的试验

兔出血症(RHD)病毒 难于适应组织细胞培养,因此 对该病毒需经兔体传代,取死 亡兔的肝脏或脾脏组织保存病毒。近年来发现,兔出血症病毒在低温条件下可存活较长时间。但对于该病毒的确切的保存时间还未见报道。本人对本课题组分离保存的及向有关单位索取保存的不同来源、不同保存时间的毒株,进行血凝抑制价的测定、免疫电镜观察及动物接种试验,掌握兔出血症病毒在保存过程中的变化情况,为该病毒的保存与传代提供科学依据。 (一)材料与方法     

兔出血症病毒VP60蛋白与受体HBGAs结合位点的初步分析

通过血凝抑制试验筛选含H型组织血型抗原(HBGAs)的唾液样品,采用正交连续稀释法建立了兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60与HBGAs受体结合的酶联免疫方法,并用该方法检测了VP60蛋白的截短表达蛋白片段与HBGAs的结合情况,分析衣壳蛋白VP60与HBGAs的结合位点。结果表明,蛋白片段P250~350、P330~440、P330~350能与H型HBGAs结合,而蛋白片段P470~579、P559~579不能与H型HBGAs唾液结合。由此推断VP60蛋白与受体HBGAs结合位点大约在330~350aa区域内。本研究成功建立了HBGAs结合试验,为探索RHDV与宿主的相互作用提供了一种可靠的研究手段。     

抗兔出血症病毒单克隆抗体的制备

用1∶10稀释的兔出血症病毒(RHDV)加等量佐剂乳化后接种BALB/C小鼠3次,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。通过用间接ELISA试验筛选、克隆出分泌抗RHDV单克隆抗体的杂交瘤细胞林E_3E_6。     

牛白血病病毒的分离与鉴定

牛白血病自从1878年由德国学者报道以来,在丹麦、瑞典、美国及苏联一些国家相继发生。最近十余年,疫情不断扩大。美国、智利、古巴、以色列、日本曾先后有发病的报道。我国于1976年在安徽合肥首次发现本病,之后上海、江苏、广东、陕西、新疆、北京、湖北、浙江、黑龙江等省(区)相继有发病的报道,且有逐渐扩大蔓延的趋势。作者自1980年对牛白血病病毒作了分离与鉴定。通过几年来的努力,取得了一定的进展,给牛白血病的诊断及免疫工作创造了条件。     

蓝舌病病毒灭活抗原的研究

蓝舌病是危害养羊业最严重的一种世界性传染病。其病原为蓝舌病病毒,属于呼肠弧病毒科环状病毒属。截止目前该病毒发现22个血清型。这种多型性对诊断和防制本病带来一定的困难。经过多年的研究,许多国家在本病的诊断方面取得了显著成绩。多种血清学诊断方法研制成功,群特异性(group-specificity) 方法(琼脂扩散试验、改良补体结合试验、免疫荧光方法、酶联免疫吸附方法)和型特异性(type—specificity)方法(中和试验、红血球凝集抑制试验等)在生产中得到推广应用。但上述方法中有时使用活的病毒,对无蓝舌病的国家是一种潜在性的危险。为此,开展了病毒免疫活性的灭活方法的研究。本文介绍了几种灭活方法对比实验内容,并研制成一种可供诊断用的灭活病毒,为制     

表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组新城疫病毒在小鼠中的免疫原性

为了防控严重威胁我国的外来动物疫病非洲猪瘟,应用反向遗传操作系统构建了表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的重组新城疫病毒rNDV-p30。通过免疫印迹试验鉴定了ASFV p30蛋白的表达,连续传代后经RT-PCR证实了外源基因稳定存在。另外,比较了该重组病毒和亲本病毒对鸡胚和雏鸡的致病性以及在BHK21细胞上的生长特性;将重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中诱导产生的p30蛋白特异性抗体水平。结果显示,相对亲本病毒而言,重组病毒在细胞上的生长能力略有降低,毒力被致弱;免疫小鼠可以产生针对ASFV p30蛋白的特异性IgG。重组病毒rNDV-p30对于非洲猪瘟的防控具有重要的战略储备意义。     

非洲马瘟病毒VP7基因在重组杆状病毒中的表达及抗原性检测

利用pFastBacHTA质粒将非洲马瘟病毒(AHSV)血清4型的VP7基因重组入杆状病毒,并感染昆虫细胞Sf9。结果显示,VP7蛋白在真核细胞内获得了表达,但表达量较低。免疫印迹试验证实,VP7重组蛋白具有较好的免疫原性,将其作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测AHSV的间接酶联免疫吸附试验方法。     

猪瘟病毒IPMA检测方法的建立

为建立一种可定位和直观判断的猪瘟病毒检测方法,本研究应用猪瘟单克隆抗体作为一抗,建立了猪瘟病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验检测体系,并对其相关的反应条件进行优化,对其特异性、灵敏性、重复性和可靠性进行了检测。结果显示,最佳病毒接种量为0.5个TCID_(50)(TCID_(50)为1×10~(-5)/mL),固定前最佳的病毒孵育时间为48 h,一抗的最佳稀释度为1∶300,二抗的最佳稀释度为1∶2 000。所建立的猪瘟病毒免疫过氧化物酶单层细胞试验与其他几种常见猪病毒无交叉反应。在对300份来自不同地区的临床血样检测中,IPMA与RT-PCR和ELISA阳性检测结果符合率可达92%以上。研究结果说明,该方法具有良好的特异性、敏感性和可靠性。本研究为高效和便捷的猪瘟临床检测方法的研发奠定了基础。     

Dot-ELISA检测牛白血病病毒抗体的研究

用免疫亲和层析提纯技术获取高纯度的BLV抗原,并用EDTA处理被检血清,以免疫琼扩(ID)的检测结果为标准,建立一种快速特异的斑点酶联免疫吸附试验(Dot—ELISA),用于检测牛白血病病毒(BLV)血清抗体。其检测结果阳性者完全复盖并高于ID试验的检出率。而超出于ID试验的阳性部份,与ELISA法测得阳性结果完全符合。本法比ID试验高5.6％,并可提前60多个小时报告结果。比ELISA法亦可提前十几个小时得出结果。而且不需要特殊仪器设备,是一种特异性强,敏感性良好而且快速的免疫学检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单抗的制备与鉴定

为制备及鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要结构糖蛋白GP5单克隆抗体,本研究首先利用切向流系统和琼脂糖凝胶层析对PRRSV高致病性毒株HN07-1进行纯化;将纯化后的病毒作为免疫原免疫小鼠;取免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合;通过免疫过氧化物酶单层细胞试验对杂交瘤细胞株进行检测及筛选;利用重组GP5蛋白对阳性单克隆上清进行免疫印迹分析鉴定;经激光扫描共聚焦显微术和流式细胞术进一步鉴定单抗与病毒的结合特性。本研究共筛选到4株针对GP5蛋白的单克隆抗体,分别被命名为2D1G11、2D1C1、4H9D1和8B9D4;通过激光共聚焦显微镜观察发现,以上这4株GP5单抗均可以与病毒特异性结合;进一步通过流式细胞术检测发现,这4株GP5单抗与病毒的结合能力超过N单抗。通过亚型鉴定发现,2D1G11、2D1C1属于Ig G2亚型,4H9D1、8B9D4为Ig G1亚型。PRRSV GP5蛋白特异性单抗的成功制备,为PRRSV快速诊断试剂研制及免疫识别研究提供了分子手段和工具支持。     

抗兔轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用小鼠骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）与经兔轮状病毒（ＬａＲＶ）免疫的ＢＡＬＢ／ｃ。系小鼠脾细胞进行融合，融合成功率为２２％。经间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）筛速杂交瘤细胞，阳性率为２９％左右。对其中６株强阳性的杂交瘤细胞进行了亚克隆，获得高产亚克隆杂交名细胞，用ＢＡＬＢ／ｃ小鼠生产了腹水，鉴定后选取２株强阳性高效阶的杂交瘤细胞，以ＥＬＩＳＡ阻断试验检验其分泌抗体的特异性，以直接ＥＬＩＳＡ测其敏感性，用琼脂双扩散试验鉴定类和亚类型别。结果１Ｂ＿３为ＩｇＧ，，２Ｂ＿４为ＩｇＧ＿（２ｂ）。     

应用酶联免疫吸附试验诊断弓形虫病

1984～1986年,本课题协作组在广西、北京、福建、安徽、黑龙江、浙江等省市的6个单位进行了弓形虫病酶联免疫吸附试验诊断方法的研究,建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)。 葡萄球菌A蛋白—酶联免疫吸附试验(SPA—ELISA)固相免疫酶底物珠试验(DASS),玻片虫体过氧化物酶联免疫吸附试验(TSHE),玻片虫体—葡萄球菌A蛋白酶联吸附试验(TSSH)5种酶联试验方法,现汇总报告如下。     

用猪瘟兔化弱毒中和试验检测猪瘟抗体

1984年9月在中国兽药监察所主持下,部属有关药厂参加,在我厂进行猪瘟兔化弱毒毒种安全试验时,发现注苗后21天的免疫猪,采血分离血清,用100个感染剂量的猪瘟兔化弱毒作兔体中和试验(兽医生物药品制造及检验规程方法,下简称规程法)检不出中和抗体。为此,我们对这一问题作了进一步的试验。现将试验结果报告如下。     

传染性腔上囊病病毒广西流行株免疫原性的研究

分别制备传染性腔上囊病病毒(IBDV)广西流行毒株040124、BH11、TSC-2(9)和YL052以及参考强毒株CJ801-BKF的灭活油乳荆疫苗(OEV)及其多价OEV,分别进行IBD商品疫苗毒株B87(in)和FW2512对4个广西流行毒株的攻毒免疫保护试验、流行毒株间的免疫交叉保护试验、多价OEV不同免疫剂量及其与CJ801-BKF株OEV的免疫保护对比试验.结果显示,2个IBD商品疫苗均不能对4个流行毒株提供完全的保护;4个流行毒株的OEV对同源毒株的攻毒均可产生100%保护,其中040124株OEV的交叉免疫保护性最好;在毒株免疫组与未免疫组免疫器官指数的比较中发现,TSC-2(9)株OEV免疫鸡的免疫器官受病毒的损伤程度最严重,而040124、BH11和YL052株OEV的免疫均能较好地保护鸡的免疫器官免受病毒的损伤;多价OEV 3个免疫剂量的免疫保护指数(IPI)为80%～100%,1mL免疫组的IPI显著高于0.25 mL免疫组(P＜0.05),而1 mL免疫组与0.5 mL免疫组差异不显著(P＞0.05);多价OEV的免疫效力显著高于毒株YL052、TSC-2(9)和CJ801-BKF的OEV(P＜0.05).结果表明,本研究制备的多价灭活疫苗适用于本地IBD的防制.     

鸭病毒性肝炎病毒RNA聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位

为研究鸭病毒性肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶的分子生物学特性及其在细胞中的定位,构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达的真核重组表达质粒;然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测了RNA依赖性RNA聚合酶在细胞中的表达和亚细胞定位情况。结果表明,RNA依赖性RNA聚合酶能与增强型绿色荧光蛋白一起在MDCK细胞中良好表达,且主要分布于细胞核中,Western-blot分析结果显示,融合蛋白在80ku处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性。表明成功构建了RNA依赖性RNA聚合酶与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体,并在真核细胞内实现了表达,通过检测荧光蛋白,发现RNA依赖性RNA聚合酶主要在细胞核中发挥复制酶的功能。     

H4和H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单因子血清的制备

为制备H4和H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单因子血清,以便快速鉴定H4以及H6亚型禽流感病毒,根据GenBank中A/Duck/Hunan/S11090/2012(H4N6)和A/Chicken/Guangdong/S1312/2010(H6N2)的血凝素基因序列,人工合成并进行密码子优化后插入真核表达载体pCAGGs,通过双酶切鉴定以及测序确定重组质粒构建成功。给每只SPF鸡注射免疫200μg重组质粒,免疫周期为30d,第3次免疫后第10天,通过心脏采血收获单因子血清。间接免疫荧光试验和Western-blot试验的结果表明,重组质粒中HA基因均被成功表达。利用H4和H6亚型禽流感病毒抗原进行血凝抑制试验,结果显示抗体效价均在64至128之间,表明制备的单因子血清抗体效价较高,敏感性强。使用其他亚型的禽流感病毒以及新城疫病毒为抗原进行血凝抑制试验发现结果均为阴性,表明制备的单因子血清与其他亚型禽流感病毒及新城疫病毒无交叉反应。     

猪瘟兔化弱毒疫苗对仔猪哺乳前免疫效果的研究初报

目前采用的猪瘟兔化弱毒疫苗有效好的预防效果。但是近年发现其对哺乳仔猪的免疫效果往往不够理想。为了探讨这一问题,一些单位进行了免疫程序研究和仔猪不同日龄的免疫效果试验,但结论不一。这些研究的基本出发点都是根据仔猪哺乳后,与母乳中得到猪瘟母源抗体,而母源抗体能中和疫苗抗原从而影响疫苗的免疫效果。所以,如何排除母源抗体对仔猪免疫的干扰,已成为兽医界十分关切的问题。     

免疫酶标记抗体诊断猪瘟试验

免疫酶标记抗体(直接法,以下简称酶标法)法诊断猪瘟和兔体交互免疫试验相比,具有省时、经济、不需特殊仪器等优点。但此种诊断方法是否有很高的特异性,且不受所接种疫苗的影响,能否适应在基层推广应用?为此,做了如下试验。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒纯化方法的建立

采用差速离心、膜包超滤浓缩和Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶层析相结合的策略纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),建立了一种温和纯化PRRSV的方法。通过SDS-PAGE、Western-blot和检测病毒含量、蛋白含量等方法分析纯化效果。用纯化后的病毒免疫BALB/c雌性小鼠,通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测其免疫原性,并与超速离心沉淀病毒的纯化方法相比较,评估纯化病毒的免疫效果。结果显示,4FF纯化后的病毒TCID_(50)提高了50倍,与超离方法相比,4FF纯化法将病毒原液杂蛋白的去除比率由97.51%提高到99.68%,SDS-PAGE显示未见明显杂蛋白条带,IPMA结果显示4FF纯化病毒的免疫原性较好,特异性较强,消除了免疫后小鼠血清与Marc-145细胞蛋白的非特异性反应。结果表明,4FF纯化方法优于超离纯化方法,前者的建立为制备单克隆抗体和规模化纯化PRRSV疫苗的工艺开发奠定基础。