传代细胞支原体污染的快速检查

近年来国外报道支原体对细胞的污染相当普遍。有人提出,在引用已有文献结果时,都应考虑和分析所用的细胞是否存在支原体污染,如存在支原体污染,则相应实验结果的可靠性要重新加以考虑。     

从被污染的培养细胞株中分离的支原体

支原体广泛分布于自然界,是一类可用人工培养基培养的最小微生物。因此,它常常容易污染组织培养细胞,造成不良后果。例如支原体能消耗培养液中的主要营养物(如精氨酸等),从而干扰某些病毒的生长;双倍体细胞被支原体污染后,可使其早期衰老;用组织培养制备病毒抗原时,由于支原体污染,使病毒抗原与支原体抗原混杂而不能成功。此外,由于有些支原体能引起细胞转化,在肿瘤病毒研究中,可能导致判定致癌结果发生错误。尾形学氏曾调查了日本几个研究所保存的60株培养细胞中,有52株被支原体污染,占86.7％。因此,在组织培养试验室,要经常注意,防止被支原体污染。David Taylor-Robinson在其综述中指出的,由被污染的培养细胞中分离出的支原体如下:     

滑液支原体DnaK的原核表达及免疫原性分析和亚细胞定位

参照GenBank中滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株dnaK基因序列(CP011096.1)设计并合成特异性引物,利用overlap PCR技术扩增获得MS dnaK基因,并将其克隆至pMD19-T载体,在序列分析的基础上将该基因克隆至pET-28a(+)质粒,构建原核表达载体pET-dnaK并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,进行SDS-PAGE分析。继而将纯化表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western-blot和免疫荧光试验对MS DnaK的免疫原性及其在细胞内的分布进行分析。结果显示,MS dna K基因全长1 791 bp,编码596个氨基酸,重组蛋白rMSDnaK在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,且其相对分子质量约为67 ku。间接ELISA和Western-blot结果表明,rMSDnaK具有良好的免疫原性,且MS DnaK在其胞浆和胞膜中均有分布,但在胞膜中含量较多,免疫荧光试验进一步证实DnaK在MS膜表面的分布。本研究结果为进一步研究MS DnaK的生物学功能奠定了基础。     

一种简便快速的吸虫卵检查法——锥形底杯沉淀集卵法

近年来我们采用锥形底杯沉淀集卵法检查粪便,并与彻底洗净法、离心沉淀法进行比较,认为锥形杯沉淀集卵法检查虫卵,不但检出率高、速度快,而且设备简单,操作容易,适用于各种吸虫卵的粪便检查,尤其适用于牛羊肝片形吸虫病的大规模普查工作。     

猪水泡病病毒与口蹄疫病毒引起寄主细胞(组织培养的肾细胞)病理过程的超微结构研究

据报导,近年在意大利和英国流行的一种新的猪水泡病病原体,认为是一种属于肠道类的病毒。对提纯病毒的电子显微镜观察说明,是直径为30～32毫微米的球状病毒(1、2)。我们用超薄切片技术,对国内某地流行的猪水泡病病毒在寄主细胞内的分布,晶格排列与形态也进行了电子显微镜观察,是直径为22～23毫微米的近似球形的病毒(3)。在前一阶段工作的基础上,我们继续研究了猪水泡病病毒引起寄主细胞(组织培养的肾上皮细胞)病理过     

西岸和加沙被占的影响

1967-1987年间以色列占领约旦河西岸和加沙地带对巴勒斯坦人产生了多方面的影响政治上，以色列试图永久控制两地，否认巴勒斯坦人的合法生存权，导致巴民族意识增强，反以斗争风起云涌；经济上，以色列控制两地经济发展，造成两地贫穷落后且经济畸形发展；以占领还使巴社会发生重大变化。     

牛支原体08M株的致病性和免疫原性试验

为了评估牛支原体08M株作为牛支原体灭活疫苗候选株的可能性,攻毒组的每头犊牛气管注射10 mL 08M(1×109CCU/mL)新鲜菌液,对照组气管注射10 mL 0.15 mol/L pH 7.2的PBS。在不同时间采集鼻拭子用realtime PCR进行排菌检测,采集血清检测感染抗体,攻毒后第28天进行剖检,观察肺部病变并进行病原分离。同时,以牛支原体08M培养物为抗原,混合MONTANIDEISA 201 VG,分别制备抗原质量浓度为0.46和1.48 mg/mL两个剂量的免疫原,以每头牛2 mL的剂量,间隔28 d颈部皮下注射犊牛2次,同时设置阴性对照组和空白对照组,二免后第28天进行攻毒试验,方法同致病性试验,免疫后在不同时间采集血清,检测血清抗体。致病性试验结果显示,攻毒组动物在攻毒后第4~14天进行间歇性排菌,第7天可以检测到感染抗体,剖检后观察到攻毒组牛肺部发生明显的病变并从肺部病变组织中分离到牛支原体。免疫原性试验结果显示,2种质量浓度的免疫原免疫动物后均能产生较高水平的血清抗体,攻毒后所有动物均进行间歇性排菌,免疫组动物血清抗体水平无明显变化,对照组动物一免后第14天血清抗体达到最高水平,剖检后所有动物肺部均有病变且都能够分离出牛支原体。结果表明,牛支原体08M株具有较强的毒力和良好的免疫原性,本试验中用牛支原体08M株制备的灭活疫苗免疫犊牛后可以使牛体产生很好的免疫反应但却没有保护作用。     

猪鼻支原体荧光PCR检测方法的建立和应用

为了建立猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）快速荧光PCR检测方法,本研究合成了该病原特异性基因P37的重组质粒,根据该基因设计荧光PCR引物和探针,并对设计的引物和探针的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法具有高度的特异性,除了识别猪鼻支原体基因组外,对猪的基因组和猪常见病原的基因组均不发生交叉反应。在敏感性和重复性试验中,该方法对猪鼻支原体的检测限为1 000copies/m L,变异系数小于3%,因此具有优良的敏感性和稳定性。用该方法检测临床样本,阳性检出率为76%(38/50),远高于普通PCR的阳性检出率（40%,20/50）。上述结果表明,本研究建立的荧光PCR方法在特异性、敏感性和稳定性方面均满足猪鼻支原体的临床检测要求,可以用于猪鼻支原体临床样品的检测。     

山羊支原体山羊肺炎亚种M17基因的原核表达及细胞定位研究

为分析山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)氨基肽酶M17的特征及细胞定位。参照GenBank中Mccp M1601株的M17基因序列,优化密码子,合成原核表达载体pET30a-M17,将鉴定正确的表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3),经IPTG诱导后获得融合表达蛋白;用其免疫新西兰兔,制备超免疫血清,并测定其效价和代谢抑制效果;通过Western-blot和i ELISA两种方法对M17在Mccp细胞内的分布进行了初步研究。结果显示,pET30a-M17重组蛋白在大肠杆菌中获得成功表达,大小约50 ku,与预期相符,密码子优化后的表达产物以可溶性和包涵体两种形式存在;免疫后的兔血清抗体效价达1∶80 000以上,说明M17重组蛋白具有较好的免疫原性和反应活性;M17多抗血清对Mccp无代谢抑制作用,但能够与Mccp的膜蛋白、胞浆蛋白及全菌蛋白发生特异性反应,表明M17蛋白在Mccp的细胞膜和细胞质中均有分布,但细胞膜中含量略高于细胞浆。M17的成功表达以及在Mccp中的细胞定位为其生物学功能研究奠定了基础,也为山羊传染性胸膜肺炎的诊断和疫苗研制提供了参考。     

鸡毒支原体鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌三重PCR检测方法的建立

鸡毒支原体(MG)、鸡滑液囊支原体(MS)、副鸡禽杆菌(APG)三重PCR诊断对于鸡呼吸道疾病的鉴别诊断和防控有着重要意义。本次试验首先对三重PCR反应条件进行优化,之后对多种病原的DNA进行扩增以确定本方法的特异性,调整MG、MS和APG的DNA浓度以确定本方法的敏感性。结果显示,利用优化后的反应条件,本试验建立的诊断方法能够同时扩增出长度为453 bp(MG)、328 bp(MS)和241 bp(APG)的特异性片段,而大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、禽多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照样品在检测时则无条带产生。对三种病原的混合DNA进行10倍梯度稀释,确定MG、MS和APG的最低检出量为5×10^-3ng/μL。对37份临床样品的检测结果表明,三重PCR的检出率和单重PCR的检测结果一致,且可同时检测出两种或三种病原同时感染。上述结果表明,本试验建立的MG、MS和APG三重PCR诊断方法具有良好的特异性、较高的灵敏性,可用于鸡呼吸道病的诊断和防控。     

绵羊和山羊嗜血支原体感染的检测及分子鉴定

为了解绵羊和山羊嗜血支原体在甘肃、辽宁、内蒙古、宁夏、重庆、海南等地的流行状况及病原种类,利用瑞氏染色方法和已发表的嗜血支原体通用qPCR方法,对2011—2015年间采自上述地区的绵羊和山羊血液样品346份进行了检测,并对部分qPCR阳性样品扩增产物进行了测序和序列分析。结果,在甘肃、内蒙古的绵羊样品中和重庆、海南的山羊样品中检出嗜血支原体;其中,瑞氏染色方法的绵羊样品阳性率为12.45%(33/265),山羊样品阳性率为24.69%(20/81);qPCR绵羊阳性率为22.26%(59/265),山羊阳性率为37.04%(30/81)。对部分阳性样品的qPCR产物进行的序列分析结果显示,绵羊样品中5/7份为绵羊支原体和绵羊嗜血支原体待定种共同感染,1/7为绵羊支原体感染,1/7为绵羊嗜血支原体待定种感染;山羊样品中,2/3为绵羊支原体感染,1/3为绵羊嗜血支原体待定种感染。本文在我国首次证实山羊和绵羊中流行绵羊支原体和绵羊嗜血支原体待定种两种不同的嗜血支原体,且绵羊中存在两种嗜血支原体共同感染的情况。     

用ELISA双抗体夹心法快速检验肉品污染的沙门氏菌

随着肉品生产的迅速发展,肉品污染沙门氏菌引起食物中毒的机会相对增多。但目前肉品污染沙门氏菌的检测方法仍用经典的常规分离培养法,费时(需4～6日)、费力,远不能适应当前肉品生产与销售对防污染监测的需要。为了改变这一状况,国内外有人报道,用沙门氏菌增菌培养物作为包被抗原的ELISA方法。笔者曾模拟了朱培坤等(1985)介绍的被检样品经沙门氏菌增菌培养后可直接作为包被抗原的ELISA检测方法,结果这种方法难以克服增菌液中其它杂蛋白的非特异性吸附,影响反应的特异性和灵敏度。在本试验中,我们用ELISA双抗体夹心法快速检测肉品中污染的沙门氏菌,获得满意结果。     

猪气喘病病原体——猪肺炎支原体的分离和培养研究

猪气喘病,据报道(华南农科所,1959)从1953年开始即引起广州地区的兽医工作者的重视。最初,他们诊断为小猪地方流行性支气管肺炎;后经深入研究,认为其特性与英国学者Betts等报道的猪病毒性肺炎的特征,大致相同。随着养猪事业的大发展,猪数急增,调动频繁,集体饲养多,猪与猪接触机会也多,再则猪的几种烈性传染病和猪瘟等已基本上获得控制;这种慢性呼吸道病才显得格外突出,流行也较广泛。经全国各地研究,全国猪气喘     

牛环形泰氏焦虫病组织培养疫苗的安全性和免疫性试验

牛泰氏焦虫病的免疫问题,很早就已为人们所重视。耐过动物产生对同系泰氏焦虫的抵抗,能有效地防止再发病。这种抵抗和不易感性,由于在耐过动物体内虫体的残留而被看成是带虫免疫(Premunition)。早在本世纪初期,就有人用患东海岸热[病原体为小泰氏焦虫(Theilefiaparva)]动物的脾脏和淋巴结的悬浮液,给牛静脉注射进行免疫。以后,     

试管法和纸片法抑菌试验的比较

试管法和纸片法抑菌试验的比较黎满香刘红旗１）陈可毅蒋武成王吉祥（湖南农业大学动物科技学院长沙４１０１２８）药物的体外抑菌试验已广泛应用于各个方面，如抗菌药物的筛选、提取过程的追踪、抗菌谱测定、含量测定以及指导医疗用药的药敏试验等。其方法分连续稀释法和...     

猪、犬的鼻饲法和洗胃法

几年来,笔者参考大家畜洗胃及人医鼻饲、洗胃方法,对猪、犬中毒病17例采用鼻饲法和洗胃法进行治疗,取得了较好效果。 (一)保定方法 站立或右侧卧保定,对小猪及犬可把两前肢抱起站立施术。 (二)胃管选择 大猪用长1.5～2米,口径4～6毫米的胃管或硬胶管;小猪和狗用人的导尿管。先从鼻腔口至剑突测距,相当于从口至胃体部距离,贴以胶布为记。 (三)插胃管 先用开口器或火钳撬开上、下颌使口张开,再把管头涂以润滑油经口腔缓缓插入,也可经鼻孔插入。当胃管到达会咽部时要轻轻刺激引起吞咽,如咽喉麻痹无吞咽动作时,可直接向咽喉稍后上方伸     

犊牛甲状腺细胞的培养和应用

犊牛甲腺(CTh)初代细胞是一种对多种病毒敏感的细胞。W.A.Snowdon(1966)指出,对于口蹄疫病毒(FMDV)来说,CTh细胞对其的敏感性比犊牛肾细胞、仔猪肾细胞、幼仓鼠肾传代细胞(BHK_(21))、乳鼠高100～1000倍。所以自1963年以后,几乎所有的牛咽部一食道刮取物的病毒分离试验(FMD查毒试验)都采用CTh细胞。另外据W.Plowright和D.Ferris(1961)报道,作者用CTh细胞成功地分离到了用牛肾细胞、羊肾和睾丸细胞难以获得的牛恶性卡他热病毒。国内,对CTh细胞的培养和研究甚少,王则兴等(1983)曾报道过有关这方面的工作。为满足活畜进口检疫工作的需要,我们参考国外有关资料,成功地培养了CTh细胞,并试用于进口动物的检疫。     

公马生长激素细胞和催乳激素细胞的形态计测学研究

利用免疫组织化学和形态计测学的方法,观察了20匹成熟雄性蒙古马的脑垂体前叶生长激素细胞和催乳激素细胞的数量和面积,同时利用放射免疫分析方法检测了这2种激素的血浆水平.结果表明,生长激素细胞的数量为10.10×108个,细胞面积为81.30 μm2;催乳激素细胞的数量为3.94×108个,细胞面积为46.03μm2.生长激素在血浆中含量为10.11ng/mL,催乳激素为1.64 ng/mL.结果提示垂体激素血浆中含量与相关细胞的组织学特征有关,而生长激素血浆中含量的个体差异可能与其搏动性分泌形式有关.     

山羊支原体山羊肺炎亚种特异性分子检测靶标的鉴定和应用

本文旨在筛选出新的山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)特异性分子诊断靶标。首先通过全基因组本地BLASTp方法筛选得到Mccp理论上特异的蛋白基因序列,经BLASTn验证、优选特异性基因92.1作为候选靶标,设计引物92.1F/R,采用普通PCR体系检测4株Mccp(1801、1601、1309F、Zly-14)和7种其他支原体基因组DNA,包括无乳支原体(Ma)PG2、丝状支原体山羊亚种(Mmc)PG3、Mmc YG(前称丝状支原体丝状亚种大菌落型,MmmLC)、绵羊肺炎支原体(Mo)Y98、山羊支原体山羊亚种(Mcc)Ckid、牛支原体(Mb)08M、李奇氏支原体(Ml)PG50,并检测Mccp、Mo、Mmc人工感染羊试验样本DNA,评估该体系的特异性。结果表明92.1F/R引物只能从Mccp菌株及其感染试验样本中扩增出509 bp目的条带,证实该引物可用于检测Mccp,92.1序列可作为CCPP新的核酸诊断靶标,为CCPP诊断和实验室研究提供了一种新的分子标记。     

免疫途径对绵羊支原体肺炎灭活疫苗安全性和抗体水平的影响

为了评价免疫途径对绵羊支原体肺炎灭活疫苗安全性和免疫效果的影响,将该疫苗分别于颈部皮下和肌肉各接种205只绵羊,对全身性反应和注射局部进行安全性观察,并于免疫当天和免疫后第21天各采集50只绵羊血分离血清,用绵羊肺炎支原体ELISA试剂盒检测血清抗体阳转率和抗体水平。结果,皮下注射组(19.5%)与肌肉注射组(17.6%)全身性不良反应均较高,差异不显著;但皮下注射组(36.6%)的局部不良反应显著高于肌肉注射组(2.4%);肌肉注射组抗体阳转率(89.8%)和平均D450值升高水平(免疫后比免疫前升高0.89)均显著高于皮下注射组(77.1%,0.45)。上述结果表明,肌肉注射绵羊支原体肺炎灭活疫苗的安全性和免疫效果优于皮下注射。