口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建

利用RT PCR和 3′cDNA末端快速扩增 (RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的 2个重叠cDNA片段 ,将其分别插入到载体 pcDNA3.1zeo( )和pGEM T Easy中 ,然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至 pcDNA3.1zeo( )载体 ,经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明 ,重组质粒 (pcDNA3.1/FMDV)携带了FMDVOH/99基因组全长cDNA序列     

泛亚型口蹄疫病毒O/China/99缺失毒株全长cDNA分子克隆的构建

设计并合成了4条O型口蹄疫病毒(FMDV)泛亚型代表毒株O/China/99基因组的引物,利用RT-PCR扩增各基因片段,酶切后连接到pOK12载体上,然后人工合成一段缺失PKs的5′UTR序列,利用两端的限制性内切酶位点,将该基因片段插入到上述载体中。酶切、PCR和序列测定结果显示,O/China/99株全基因组由8 200个核苷酸组成,构建的感染性cDNA与原毒株的核苷酸序列同源性为99.1%。结果表明,O/China/99缺失毒株全长cDNA分子克隆的构建成功。     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒分离株SD1009株感染性克隆的构建与病毒拯救

为探究蛋鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的致病机理,从山东省某鸡场送检的蛋鸡病料中分离鉴定出1株ALV-J,命名为SD1009株,采用PCR方法分3段扩增出SD1009株的前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后顺次连接,获得1个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009。全长测序及序列比对分析发现,近年来分离的ALV-J都存在缺失部分rTM和DR区的序列,缺失长度为205bp。通过外源基因嵌合的方式,将205bp嵌合进入,又获得了1个前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009A205,将pBW-SD1009和pBW-SD1009A205分别转染DF1细胞,通过间接免疫荧光试验,禽白血病抗原试剂盒检测,反转录酶试剂盒检验,表明拯救出了2株病毒,分别命名为rSD1009和rSD1009A205。本研究成功构建了蛋鸡ALV-J的感染性克隆,并在序列分析的基础上,又构建了第2株补全缺失序列的感染性克隆,结果表明缺失部分rTM和DR区的序列,对病毒的拯救以及病毒的复制动力学无显著影响。     

猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采集自新疆沙湾地区某猪场的疑似仔猪多系统衰竭综合征病料猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组进行了扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,命名为XJ-SW1、XJ-SW2(Gen-Bank登录号:JN639856,JN639857)。经对阳性样品进行克隆、测定,并应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示,2株病毒的基因组全长均为1 768nt;XJ-SW1株与我国山东DE株(GenBank登录号:HM142897)的同源性最高(为97.91%);XJ-SW2株与韩国G2284株(GenBank登录号:JF317587)的同源性最高(为97.51%)。PCV2全基因组序列的进化分析表明,2株病毒为PCV2e基因亚型;对2株病毒与5个不同基因亚型的15株病毒的ORF2氨基酸序列进行比较,结果显示,XJ-SW1、XJ-SW2在ORF2的氨基端与PCV2d同源性较高,在羧基端与PCV2e同源性较高。表明,在新疆沙湾猪场流行的PCV2毒株为PCV2e,该毒株的ORF2存在一定变异。     

羊O/P液中Asia Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因3''端序列的分析

从宁夏中卫Asia Ⅰ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液(OPF)中扩增得到了4个口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因3'-端483 bp(VP483)片段.核苷酸和氨基酸序列比较结果表明,从4份OPF中扩增出的VP1片段,在细胞受体结合位点处的关键氨基酸与目前公布的FMDV Asia Ⅰ型流行毒相比均发生了改变,由RGD变成RDD.4个扩增片段的核苷酸序列与Asia Ⅰ/JS/WX/05株相比,同源性为96.2%～98.3%,表明与Asia Ⅰ/JS/WX/05株高度同源.蛋白结构模拟结果显示,这种改变会导致G-H环柔性减弱,这可能是Asia Ⅰ/JS/WX/05 FMDV适应羊体,造成持续感染后发生的一种变异.     

口蹄疫病毒真核表达质粒的构建及序列分析

根据定点突变的原理 ,获得包含有口蹄疫病毒P1、2A、3C及部分 2B编码区的目的基因片段 ,经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后 ,与经同样处理的真核表达质粒载体 pcDNA3.1(+ )连接。经鉴定及DNA序列分析 ,口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(+ )上 ,且目的基因上的XbaⅠ位点成功突变     

Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒的构建及表达

为了构建Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒,采用多表位基因串联策略,合成包括口蹄疫病毒T细胞和B细胞表位基因的基因片段F,该基因片段由结构蛋白VP1上的2个B细胞表位(VP1135-159aa、VP1194-211aa)基因、非结构蛋白3A和3D上的T细胞表位(3A21-35aa、3D795-803aa)基因组成。利用限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ将基因片段F克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切鉴定、序列分析正确后,利用LipofectamineTM2000将阳性重组质粒pc-F转染至BHK-21细胞。Western-blot和IFA分析结果显示,所表达的蛋白大小约25.4ku,能够与Asia 1型口蹄疫病毒标准兔抗血清发生特异性反应,证实所表达的蛋白具有较好的反应原性。结果表明,Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒pc-F构建成功,且能在BHK-21细胞中正确表达。     

口蹄疫病毒诱导的牛α -干扰素基因cDNA的克隆及序列分析

参照已发表的牛α 干扰素基因cDNA序列设计了 1对引物 ,用感染口蹄疫病毒的牛外周血为材料 ,提取总RNA。经RT PCR ,获得与预期大小相符的DNA片段。所获得的PCR产物长度是 6 0 4bp ,与参考序列的同源性是 99.7%。第 2 3位～ 91位的 6 9个碱基为信号肽序列 ,编码2 3个氨基酸。与参考序列比较 ,第 4 3位的碱基由C变为A ,即由TTC→TTA ,对应的氨基酸由苯丙氨酸 (F)变为亮氨酸 (L)。第 4 5位的碱基由G变为C ,即由CGA→CCA ,对应的氨基酸由精氨酸(R)变为脯氨酸 (P)。第 92～ 5 89位的 4 98个碱基为牛α 干扰素成熟蛋白基因序列 ,编码 16 6个氨基酸 ,与参考序列完全相同 ,即同源性为 10 0 %。第 5 90～ 5 92位的碱基为TGA终止子。整个牛α 干扰素前体蛋白基因共 5 70个碱基 ,编码 189个氨基酸     

猪输血性传播病毒2型全基因组的克隆与序列分析

为了监测猪输血性传播病毒2型(TTV2)的疫源和进化情况,为进一步研究TTV2的形态结构、遗传变异和基因功能奠定生物学基础,参照国外发表的猪输血性传播病毒(TTV)全基因组核苷酸序列(GU456386.1),设计3对特异性引物,采用巢式PCR对采自四川省的疑似猪输血性传播病毒感染的血清样品进行TTV全基因组的克隆、测序和拼接,并对其进行同源性分析和遗传进化分析。结果显示,该基因组全长2 802bp,与国内外参考株同源性介于87%～96%之间,ORF1的同源性介于81%～95%;ORF2的同源性较高,介于93%～99%之间。系统进化树分析表明,该分离株与美国株PTTV2c-VA的同源性高达96%。结果表明,该毒株为TTV2,与国内外参考株有一定的相似性。     

Asia 1 型口蹄疫病毒多表位基因的设计及其在毕赤酵母中的表达

为制备Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)特异性诊断抗原,根据国内Asia 1型FMDV流行毒株的序列,合成了2个FMDV流行毒株VPl基因的5个抗原表位.采用Insight Ⅱ软件进行蛋白空间构象模拟,证实设计的多表位分子结构符合要求.将合成的多表位基因按设计的酶切位点进行酶切连接,构建了Asia 1型FMDV VP1双拷贝基因重组质粒(pMD18-dVP1Asia).从该重组质粒获得dVP1Asia基因,与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,构建了重组表达质粒pPIC9K-dVP1Asia.用BglⅡ将重组表达质粒线性化后,转化GS115酵母菌.经筛选、鉴定,成功获得了表达FMDV多表位VP1蛋白的阳性重组酵母茵.该阳性重组酵母茵经甲醇诱导,在培养液上清中可检测到目的蛋白.Western-blot结果显示,该蛋白能特异识别Asia 1型FMDV抗体,且具有很好的反应原性.     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因和牛α-干扰素基因的融合表达

将AsiaⅠ型口蹄疫病毒YNBS/58株VP1基因和去信号肽的牛α-干扰素基因共同亚克隆于原核表达载体 pET-28a中,转化 BL21 后经 IPTG诱导,实现了重组融合蛋白 VP1-BoIFN -α在大肠埃希氏菌 BL21 中的高效表达,表达产物经 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析,重组的VP1-BoIFN-α蛋白分子质量约为 46 ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示,重组蛋白 VP1-BoIFN-α的表达量占菌体总蛋白的30%,且以包涵体的形式存在。包涵体提取物用 8 mol/L尿素溶解后,在变性条件下利用Ni-NTA柱对VP1-BoIFN-α融合蛋白进行了纯化。     

鸭坦布苏病毒AH-F10株全基因组的分子克隆与序列分析

为了解鸭坦布苏病毒安徽分离株AH-F10的分子特征,利用RT-PCR方法对其全基因组序列进行了克隆,并将全基因组及其推导的氨基酸序列与参考毒株进行序列比对及系统进化分析。结果显示,毒株AH-F10的全基因组序列长10 990nt,含有1个大的阅读框架,两侧各有一个非编码区(Untranslation region,UTR)。序列比对结果表明,AH-F10株与13株参考毒株的基因编码区具有较高的氨基酸序列同源性,其中与江苏JS2010株的同源性最高,达98%。研究还发现,鸭坦布苏病毒各分离株的5′UTR的序列表现一定程度的变异,AH-F10株与参考株的核苷酸序列同源性在94%~97%之间。此研究结果为进一步了解鸭坦布苏病毒的遗传变异及构建该病毒的反向遗传学操作系统奠定了基础。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

基于单质粒拯救系统的塞内卡病毒感染性克隆的构建与生物学特性

参考甲型塞内卡病毒（SVA）CH/HuB/2017株全基因组序列,构建SVA通用型载体,合成SVA FragⅠ和FragⅡ基因片段,并通过无缝克隆技术依次将病毒基因片段插入通用型载体,获得包含病毒全基因组的真核转录质粒pcDNA-SVA;经双酶切和测序验证后,在IBRS-2细胞上进行转染和传代,以获得拯救毒株rSVA-CH/HuB/2017;经遗传稳定性评价后,利用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光和半数组织培养感染量等试验,鉴定和分析拯救毒株在猪肾细胞系IBRS-2和PK-15中的生物学特性。结果显示,重组质粒pcDNASVA直接转染普通敏感细胞系IBRS-2,即可快速拯救出含有沉默突变NheⅠ分子标记的毒株,且具有良好的遗传稳定性;拯救毒株和野生亲本毒株在IBRS-2和PK-15细胞中的复制和增殖特性相似。结果表明,通过建立一种基于T7启动子、RNA聚合酶Ⅱ启动子、终止子、核酶HamRz和HDVRz等元件的SVA单质粒高效拯救系统,可以在质粒水平快速编辑病毒基因组,为定向改造和拯救病毒提供了基础性技术平台。     

猪流感病毒分离株HA基因的克隆与序列分析

从1株H3N2亚型猪流感病毒(SIV)中提取RNA,用RT-PCR方法扩增了其HA基因的全长cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果,扩增的H3N2亚型SIV HA基因长度为1 701个核苷酸,共编码566个氨基酸。核苷酸序列与已发表的中国香港、中国大陆、美国及欧洲分离的H3亚型毒株相近,核苷酸和氨基酸序列相似性均在97%以上,同属H3亚型。其HA1、HA2之间切割位点序列为PSIQSR↓G,从分子水平推论,属于非高致病力毒株。其推导的氨基酸序列中有8个糖基化位点,7个位于HA1基因的第8、22、38、63、126、165、285位点,1个位于HA2基因的154位点。研究数据已提交至GenBank,并申请到一个登录号EF569597。研究结果为我国流感病毒基因库的建立、流感疫情的监测和防制提供了理论依据和技术资料储备。     

猪圆环病毒2型山东株全基因组的克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从山东疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,进行PCR扩增.回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-T-PCV2,并对筛选出的阳性质粒进行测序.结果表明,克隆得到的PCV2山东株的全基因组长为1 767 bp.应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中登录的国内外PCV毒株进行同源性比较.结果显示,PCV2山东株与国内外毒株的核苷酸同源性高达99.6%,推导的氨基酸同源性达95.4 %.进化树分析结果显示,PCV2山东株与GZ(EF515839)株同源性最高,表明,PCV2各分离毒株在进化方面存在地域上的相关性.