17β-雌二醇对海马组织结构和GFAP表达的影响

为研究17β-雌二醇对脑的保护作用机制,以去卵巢大鼠为动物模型,采用甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和透射电镜技术,观察了17β-雌二醇对海马组织结构和胶质纤维酸性蛋白表达的影响。结果显示:①与对照组、假手术组和去卵巢后补充雌激素组比较,在去卵巢组中,海马CA1～3区、齿状回神经元数量显著减少(P<0.05),CA4区神经元数量减少不显著(P>0.05);海马CA1～4区、齿状回星形胶质细胞数量增加不显著(P>0.05);海马CA1～4区、齿状回胶质纤维酸性蛋白表达增加,除CA4区与去卵巢后补充雌激素组之间无显著差异外(P>0.05),其余均差异显著(P<0.05);海马CA1区神经元、胶质细胞线粒体肿胀,神经元突触和突触囊泡减少,轴突变性;②与去卵巢组比较,去卵巢后补充雌激素组海马CA1～3区、齿状回神经元数量明显增加(P<0.05);海马CA1～4区、齿状回星形胶质细胞数量减少不显著(P>0.05);海马CA1～3区、齿状回胶质纤维酸性蛋白表达显著降低(P<0.05);保持了海马CA1区神经元和胶质细胞超微结构的正常。结果表明,17β-雌二醇能通过增加神经元数量,降低星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白表达,保持神经元和胶质细胞正常的超微结构,实现对海马的保护。     

产肠毒素性大肠杆菌K88的致病特性及其益生菌的筛选

在获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的菌株K88-GFP并证明其与K88具有遗传同质性的基础上,以K88-GFP为致病菌,腹腔注射侵染小鼠,在不同时间进行眼球采血,测定血液生理生化指标,并采取不同器官或组织,培养后利用紫外光激发K88-GFP的绿色荧光,观察计数这种产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)在小鼠体内的分布.同时通过体外抑制和活体饲喂试验,进行了益生菌的筛选.结果证实,ETEC致病菌具有较强的侵袭性,它可以侵袭小鼠肝、肾、心、肺及脑、肌肉等器官和组织,尤其可对肝、肾造成严重的损伤;筛选得到益生菌株PB JK-2,在体内外均对K88具有较好的抑制作用.     

产单核细胞李氏杆菌突变株的感染动力学研究

以BALB/c小鼠为实验动物模型,对actA基因和plcB基因双缺失的产单核细胞李氏杆菌(LM)yzuLM1-2菌株进行感染动力学研究。分别用减毒突变株yzuLM1-2和野生型菌株yzuLM4给BALB/c小鼠静脉注射或灌服,并对脏器中LM的分布动态进行测定。结果显示,在显著高于野生型菌株感染剂量的条件下注射或灌服接种后,减毒突变株组小鼠肝和脾中的LM数量迅速下降,被清除的速度显著快于野生型菌株组。溶血素(LLO)抗体的测定结果显示,减毒突变株菌能和野生型菌同样激发较高水平的抗体。小鼠免疫保护试验结果显示,减毒突变株免疫组对同种血清型LM的攻击具有较好的免疫保护力,可达100%。结果表明,yzuLM1-2突变株侵袭力下降,致病力降低,能激发较高水平的抗体产生,可以作为预防动物李氏杆菌病的候选疫苗菌株,并为用作运送外源保护性抗原的载体提供了材料。     

VP7-CTB融合蛋白在拟南芥种子中的表达及免疫原性分析

为了研发植物来源的轮状病毒疫苗,采用模式植物拟南芥作为生物反应器,将轮状病毒主要中和抗原基因VP7融合CTB,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得了含有VP7-CTB的转基因拟南芥稳定株系,并分析其种子表达蛋白的免疫原性。首先,根据拟南芥密码子的偏好性,设计合成优化的VP7和CTB基因,构建植物表达载体pPHAP1301-his-VP7-linker-CTB;再通过农杆菌介导的Floral Dip法转化拟南芥,收获T0代种子后播种,喷用草铵膦筛选转基因拟南芥获得T1代种子,重复上述过程最终获得T3代拟南芥种子,通过RT-PCR、W estern-bolt、ELISA等进行分析。结果表明,his-VP7-linker-CTB基因已成功整合到拟南芥的基因组并进行了转录和蛋白表达,并且VP7蛋白占总可溶性蛋白的0.39%,即转基因拟南芥种子中所含目的蛋白为52.65 g/g。最后,用转基因拟南芥稳定株系种子中的可溶性蛋白口服免疫小鼠,使小鼠获得免疫原性;乳鼠攻毒试验证明,母鼠免疫后产生的抗体能够有效传递给子代,具有很好的保护作用。     

马链球菌兽疫亚种纤连蛋白结合蛋白的原核表达及其免疫原性的检测

根据已发表的纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FNZ)基因(fnz)序列,设计并合成1对引物,以马链球菌兽疫亚种(SEZ)ATCC35246菌株基因组DNA为模板,PCR扩增fnz基因,并定向将其克隆至表达载体pET-32a(+)中。重组质粒pET-32a(+)-fnz经酶切及测序鉴定后,在大肠杆菌BL21中进行诱导表达,表达产物经Western-blot检测后进行纯化,得到了74ku的纯化蛋白。以纯化的FNZ与ISA206佐剂以1∶1的体积比混合后免疫ICR小鼠,每只小鼠背部皮下多点注射120μL(含蛋白22.5μg),14d后以同样方法进行加强免疫。间接ELISA检测结果表明,FNZ免疫组小鼠的血清FNZ抗体效价显著高于其他3个对照组。二免后第15天小鼠腹腔注射ATCC35246菌液5.0×105 CFU(10LD50),观察注射后10d内小鼠的临床表现及存活状况;结果显示,FNZ免疫组小鼠的存活率为62.5%,显著高于阴性对照组(0)和空白对照组(0),但低于SEZ灭活疫苗免疫组(87.5%)。结果表明,FNZ可使免疫小鼠对SEZ的感染产生一定的抵抗作用。     

转基因小鼠研究在家畜基因工程中的意义

Gordon等(1980)将外源基因导入小鼠受精卵中,得到转基因小鼠。这是人类首次成功地把外源克隆基因转移到哺乳动物基因组内。目前,国外已有十几种外源性基因成功地转移到小鼠体内。并对转基因小鼠进行了广泛深入的研究,从转基因方法(技术)到外源基因整合、表达等基础理论方面积累了丰富的资料。(一)转基因动物产生的方法1.DNA显微注射法:这种方法是把克隆DNA直接注入到受精卵的一个原核中。在小鼠,一般把DNA注入到雄原核中,而此时雄原核较雌     

犬干扰素α4在CHO细胞中的稳定表达

为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其他3种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev和pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP)。用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞。用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现绿色荧光,用MDCK与MDB K细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒活性,活性分别为1.39×105和2.19×104U/m L。本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了试验基础。     

伊维菌素对内毒血症小鼠生存率和细胞因子分泌的影响

为研究伊维菌素对脂多糖所致内毒血症小鼠的保护率及对小鼠血清中细胞因子的影响,给C57BL/6小鼠灌服伊维菌素(1、2和4mg/kg)或等体积蒸馏水,2h后分别腹腔注射脂多糖32mg/kg或等体积PBS,观察7d内小鼠的死亡情况;采用夹心-ELISA法测定注射脂多糖后不同时间点小鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平,硝酸还原法测定小鼠血清中NO的水平。结果显示,伊维菌素能显著(P<0.05)提高脂多糖诱导的内毒血症小鼠生存率,降低小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6和NO水平。表明,伊维菌素可通过抑制脂多糖诱导的小鼠体内炎性因子和介质释放提高内毒血症小鼠的生存率。     

马链球菌兽疫亚种串联表达蛋白对小鼠免疫效果的评价

根据马链球菌兽疫亚种类M蛋白(SzP)、纤维结合素结合蛋白(FNZ)、IgG结合蛋白(ZAG)的基因序列,分别设计并合成引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246的基因组为模板,扩增szp(527~1 044bp)、fnz(1 012~1 519bp)、zag(134~664bp)基因序列,并构建原核表达载体pET-32a(+)-szp、pET-32a(+)-fnz、pET-32a(+)-zag。确定诱导表达的三种蛋白都具有免疫原性后,通过PCR串联的方法,将以上3个目的片段同时串联克隆到表达载体pET-32a(+)中。重组质粒转化入大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达分子质量约为74ku的串联融合蛋白SzP-FNZ-ZAG。免疫印迹分析结果表明,上述融合蛋白能够与ATCC35246鼠源多克隆抗体发生结合反应。分别用纯化的单个蛋白和串联重组蛋白免疫ICR小鼠,能够诱导免疫小鼠产生较高效价的血清抗体,串联重组蛋白对致死剂量的马链球菌兽疫亚种强毒菌株的攻击具有90%的免疫保护率,显著高于单个蛋白。RT-PCR检测显示,免疫小鼠IL-4、IFN-γ基因的转录水平显著高于空白对照组小鼠。     

微波辐射对小鼠睾丸组织结构及功能的影响

为了探讨微波辐射对小鼠睾丸组织结构及功能的影响,本试验采用0 mw/cm2(对照组)、1 mw/cm2(低剂量组)、2 mw/cm2(高剂量组)3种辐射强度的微波(1 800 MHz)对青春期前雄性小鼠进行辐射处理,处理期自受胎开始至出生后30日龄,每组20只。采用透射电镜方法观察小鼠睾丸组织的改变,用免疫组化方法、Western-blot观察StAR蛋白的表达。采用RT-PCR方法和ELISA测定微波辐射后睾丸组织中StAR、SF-1、P450scc mRNA水平及血清睾酮含量。超微结构观察发现,辐射组的间质细胞线粒体水肿、脂滴明显增多、核周隙扩张,初级精母细胞内质网扩张、核膜间隙增宽。与对照组比较,辐射组血清睾酮含量和睾丸组织StRA、SF-1、P450scc mRNA、StAR蛋白表达量明显降低(P0.05)。结论:微波对小鼠睾丸组织存在明显损伤效应,微波辐射可影响睾丸间质细胞StRA、SF-1、P450scc m RNA、StAR蛋白表达而降低睾酮的合成,进而对对小鼠睾丸组织结构及功能造成影响。     

中药提取物对应激小鼠肠道上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量及IL-2水平的影响

为了观察中药提取物对应激小鼠肠黏膜屏障结构的影响,给10只C57BL/J健康应激小鼠连续灌服中药提取物,7d后光镜下观察小肠上皮内淋巴细胞(IEL)、杯状细胞(GC)的数量变化及测定肠黏膜IL-2的水平。结果显示,应激小鼠的肠黏膜IEL和GC的数量及肠黏膜IL-2水平下降;灌服中药提取物应激小鼠的肠黏膜IEL和GC的数量及肠黏膜IL-2水平与正常对照组无显著差异(P>0.05),而与未灌服中药提取物的应激小鼠相比,上述检测指标有显著性差异(P<0.05)。结果证实,该中药提取物在一定程度上可以增强应激小鼠小肠黏膜的屏障作用并提高小鼠免疫功能,增强抗应激能力。     

猪瘟病毒表面抗原E2-E~(rns)蛋白在拟南芥种子中的表达及抗原性分析

根据拟南芥密码子偏好性对猪瘟病毒表面抗原基因E2和E~(rns)的序列进行优化,并将优化的E2-E~(rns)基因克隆入植物表达载体中;利用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,通过1%草铵膦喷洒筛选阳性植株,利用PCR鉴定阳性植株;提取阳性种子总蛋白进行ELISA检测评价重组E2-E~(rns)蛋白的免疫反应原性;用E2-E~(rns)融合蛋白灌胃免疫小鼠并检测其血清中的特异抗体效价。结果,成功构建了由菜豆蛋白启动子驱动的种子特异性表达目的基因的植物表达载体p PHAP1301-E2-E~(rns),并利用拟南芥成功表达了猪瘟病毒表面抗原E2-E~(rns)融合蛋白。免疫试验结果表明,通过拟南芥表达的E2-E~(rns)融合蛋白具有良好的免疫反应原性。结果表明,本研究获得了表达E2-E~(rns)蛋白的转基因拟南芥,小鼠口服植物源E2-E~(rns)融合蛋白具有良好的抗原性,这为深入研究利用植物表达猪瘟病毒表面抗原奠定了基础。     

Crabp2对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响

为了研究胞质视黄酸结合蛋白2 (cytoplasm retinoic acid binding proteins 2,Crabp2)对猪卵泡发育的调控作用及机制,笔者通过构建猪Crabp2过表达载体并设计Crabp2 siRNA干扰片段,揭示它们对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响.通过从屠宰场回收猪卵巢,应用TRIzol法提取...     

猪囊虫TS21抗原DNA接种小鼠的免疫应答

将 4 0只BALB/c小鼠随机分为 2组 ,A组以VR10 2 0免疫作为对照 ,B组以TS2 1抗原基因的真核表达型质粒VTS2 1免疫。用ELISA检测免疫小鼠IgG总量和特异性抗体水平 ,MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞伴刀豆蛋白A(ConA)刺激的增殖反应及IL 2的诱生活性 ,常规法检测外周血免疫细胞数量的动态变化。结果显示 ,VTS2 1免疫小鼠血清的IgG含量和特异性抗体效价显著高于对照组小鼠 ;免疫小鼠脾淋巴细胞ConA刺激增殖反应和IL 2诱生活性均比对照组小鼠显著增强 ;免疫小鼠的淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的数量也显著超过对照组。免疫小鼠的细胞和体液免疫反应显著增强 ,表明VTS2 1具有很强的免疫激活作用 ,有进一步研制开发成为猪囊虫病DNA疫苗的潜力     

实验小鼠多房棘球蚴及化疗后的形态学观察

本文对实验性小鼠正常多房棘球蚴以及应用西药丙硫咪唑、中药(消包丸)、中西药治疗等条件影响下的多房棘球蚴进行光、电镜观察。光镜观察结果,小鼠正常多房棘球蚴角质层板层纹理不明显,生发膜由2～3层细胞构成。囊腔内有大量原头节和育囊。经过药物治疗的小鼠多房棘球蚴都出现角质层和生发膜变薄,生发膜细胞变性坏死,囊腔内无原头节或育囊,PAS阳性反应减弱或消失。透射电镜观察结果,正常多房棘球蚴角质层由疏松排列的纤维和颗粒构成。生发膜有大量发育良好的微毛伸入角质层内,皮层区有许多具有单位膜的空泡及少量微管。皮层细胞区主要由皮层细胞和肌细胞构成。经过药物治疗后角质层纤维和颗粒数量减少,甚至完全消失,是透明状。生发膜微毛变得粗短或消失,皮层空泡增多,微管扩张破裂,线粒体固缩,高尔基体与粗面内质网解体,胞浆内出现大量脂滴,严重时生发膜细胞变性坏死形成髓样物质、不定形物质。病理变化以中西药治疗组最明显,其次是西药和中药组。     

重组牛IFN-α对亚洲Ⅰ型口蹄疫亚单位疫苗免疫小鼠的影响

在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达了牛IFN-α基因、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)VP1和VP1 C末端基因,并纯化了所表达的蛋白。用透析的方法进行蛋白复性后制成油乳剂疫苗,经皮下多点注射免疫小鼠,以MTT法检测小鼠脾淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后的增殖反应活性;以液相阻断ELISA检测血清FMDV特异抗体的变化。结果表明,重组VP1(rVP1)和rVP1 C末端蛋白能单独诱发小鼠的体液免疫反应和微量的细胞免疫反应,而与重组牛IFN-α(rBoIFN-α)共同接种的小鼠,体液免疫反应和细胞免疫反应更为明显。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP1蛋白重组腺病毒的构建及其对小鼠的免疫抑制作用

利用RT-PCR扩增获得高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SY0608株非结构蛋白基因NSP1,将其克隆至穿梭载体pShuttle-CMV,经PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,获得重组腺病毒载体,再经PacⅠ线性化后转染至HEK-293A细胞,获得重组腺病毒,IFA和Western-blot鉴定结果证明其可以表达NSP1。将该重组腺病毒2次接种ICR小鼠,每次间隔2周,于免疫后不同时间取脾淋巴细胞进行体外培养,用于淋巴细胞增殖试验,并用ELISA检测IFN-γ和IL-10水平。结果显示,与野生型腺病毒(wtAd)或DMEM对照组相比,重组腺病毒rAd-NSP1组T淋巴细胞增殖指数(SI)和IFN-γ水平显著降低,IL-10水平明显增高(P<0.05)。结果表明,高致病性PRRSV NSP1蛋白具有明显的免疫抑制作用。     

慢病毒介导的bta-miR-222稳定过表达MDBK细胞株的构建及鉴定

拟获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为后续探索bta-miR-222在MDBK细胞中的作用奠定基础。本研究使用PCR技术,从MDBK细胞基因组与pEGFP-N1质粒中扩增pri-bta-miR-222和GFP片段,胶回收,先克隆于pMD18-T载体中,转化入大肠杆菌,酶切鉴定及测序正确,再克隆于pCDH-CMVMCS-EF1-Puro载体,构建含bta-miR-222基因的miRNA慢病毒重组质粒pCDH-miR-222-GFP。将pCDHmiR-222-GFP与两个包装质粒PSP、PMD共转染293T细胞,制备含bta-miR-222基因的重组慢病毒V_(PCDH+miR-222)。用制备成功的慢病毒V_(PCDH+miR-222)感染MDBK细胞,经Puromycin嘌呤霉素筛选,荧光显微镜观察感染效率。结果显示,pCDH-miR-222-GFP过表达质粒构建成功,序列比对符合率达100%。将pCDH-miR-222-GFP、PSP和PMD共转染后,通过荧光显微镜观察到293T细胞分布大量的荧光,说明成功构建了重组慢病毒V_(PCDH+miR-222),经Puromycin嘌呤霉素筛选10代后,V_(PCDH+miR-222)在MDBK细胞中仍具有感染效率。本研究成功获取稳定表达bta-miR-222的MDBK细胞株,为进一步研究bta-miR-222在病毒感染MDBK细胞中的功能奠定了基础。     

鸡胚胎腺垂体卵泡刺激素细胞的发育及其变化

应用免疫组织化学方法,对发育的第3.5～20.5天鸡胚腺垂体卵泡刺激素(FSH)细胞的发生及其在发育过程中的变化规律进行了研究。结果,鸡胚发育的中期(第10.5天),可观察到少量明显的FSH细胞分布于腺垂体后叶,随着胚胎的发育,FSH细胞数量显著增加(P<0.05),发育的第16.5天FSH细胞数量增加到了整个孵化期的最大值,分布于垂体后叶的腹侧,前叶仅有少量零散的FSH细胞;在发育的第18.5天至出生期FSH细胞数量显著减少。早期FSH细胞体积小、细胞浆少、细胞核大,单个或团状分布,随着胚龄的增加,细胞体积增大、细胞浆增多、细胞浆浓染。结果表明,鸡胚胎腺垂体FSH细胞发生于胚胎发育的中期,细胞的增殖和分化过程发生在胚胎发育的中后期;FSH细胞分布于垂体后叶腹侧。     

卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟及其后续发育的影响

观察了卵丘细胞共培养对小鼠生发泡期部分裸露(PNO)和裸卵(NO)成熟和发育能力的影响;分别用小鼠、大鼠、猪的卵丘细胞与小鼠PNO和NO进行了共培养。检测了小鼠PNO和NO的减数分裂能力、生发泡构型、受精和胚胎发育能力。结果,PNO、NO的减数分裂能力显著(P<0.05)低于卵丘完整复合体(COCs)的减数分裂能力。COCs中SN型卵母细胞比率显著高于PNO和NO中SN型卵母细胞比率(P<0.05),大部分PNO和NO的卵母细胞核型为NSN型。与对照组相比,与小鼠或大鼠卵丘细胞共培养的小鼠PNO和NO的减数分裂能力没有显著提高,但是与猪卵丘细胞共培养却可以提高小鼠PNO和NO的减数分裂能力。结果表明,猪卵丘细胞能促进小鼠卵母细胞的体外成熟,但并不影响小鼠卵母细胞的受精和胚胎发育。