抗脂肪细胞特异膜蛋白单链抗体基因的克隆及序列分析

从分泌抗 4 0ku脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取纯化mRNA ,经RT PCR扩增抗体轻、重链可变区基因 ,然后与Linker连接组装成单链抗体基因 (scFv)。结果 ,成功地构建了scFv基因 ,其排列方式为VH linker VL。经序列分析表明 ,scFv基因全长 74 1bp ,VH基因全长 36 9bp ,VL基因全长 32 7bp。抗脂肪细胞膜蛋白单链抗体基因的构建为进行该抗体基因的表达奠定了基础     

口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位

为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至E.coli Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。     

A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF4基因编码蛋白的体外表达

为了探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF4基因结构及其所编码蛋白在PK15细胞中的表达特性,以PCV-2杭州株病毒DNA为模板进行PCR,结果扩增出了ORF4基因,并分别构建了pGEX-4T-1-ORF4原核表达载体和pEGFP-C2-ORF4真核表达载体.序列分析、SDS-PAGE分析和Western-blot检测表明,PCV-2 ORF4基因长180 bp,共编码60个氨基酸;其编码蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子质量大小约为6.685 ku.真核PK15细胞的转染试验显示,ORF4重组蛋白在PK15细胞的细胞核和细胞浆中均有表达,但对其有一定的毒性.     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

猪附红细胞体DnaJ基因的克隆及真核表达

为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列（NC₀15153.1）,应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。     

三黄鸡IFITM3基因的克隆及其真核表达载体的构建

为研究禽类干扰素诱导跨膜转运蛋白(interferon-induced transmembrane proteins,IFITMs)基因抗流感病毒的功能和分子机制,用PCR扩增了三黄鸡IFITM3基因并进行序列测定及其编码蛋白的结构分析。在此基础上,构建了pIRES2-EGFP-IFITM3真核表达载体并转染至DF-1细胞。分析结果显示,该基因随物种发育进化地位的不同而表现出种属间差异性,编码蛋白由113个氨基酸构成,存在2个潜在跨膜区,不含信号肽。转染结果显示,pIRES2-EGFP-IFITM3真核表达载体在DF-1细胞中成功表达。研究结果为构建IFITM3专性表达细胞系及三黄鸡IFITM3蛋白抗病毒分子机制的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术,扩增出口蹄疫病毒(FMDV)VP2基因,并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞,获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后,感染sf9细胞,表达VP2融合蛋白,分子质量为33 ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体,通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定,说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达,且可以与牛抗O型FMDV血清发生特异性反应。     

狂犬病“靶向性”Th表位DNA疫苗的构建与瞬时表达研究

用RT-PCR扩增BALB/c小鼠P31基因,在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变;采用定向克隆方法将狂犬病病毒核蛋白、糖蛋白及NS蛋白主要Th抗原表位核苷酸序列替换P31序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应获得带有Kozak调控序列的P31-Th分子,以增加目的基因的表达量,并将含有Kozak序列的P31-Th分子克隆入真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定;最后将各Th表位表达载体转染COS-7细胞,Western-blot检测目的基因的瞬时表达。测序分析结果表明,BALB/c小鼠P31基因CDS区长648bp,编码215个氨基酸,与Gen-Bank中登录的Ii分子（NM₀10545）的核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异;定点突变后获得了P31分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明,成功构建了携带P31-Th分子的真核表达载体;Western-blot分析证实,各P31-Th分子均在COS-7细胞中获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P31多克隆抗体发生抗原抗体结合反应。结果表明,作者成功构建了狂犬病病毒主要Th抗原表位的"靶向性"核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒的构建及表达

为了构建Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒,采用多表位基因串联策略,合成包括口蹄疫病毒T细胞和B细胞表位基因的基因片段F,该基因片段由结构蛋白VP1上的2个B细胞表位(VP1135-159aa、VP1194-211aa)基因、非结构蛋白3A和3D上的T细胞表位(3A21-35aa、3D795-803aa)基因组成。利用限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ将基因片段F克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切鉴定、序列分析正确后,利用LipofectamineTM2000将阳性重组质粒pc-F转染至BHK-21细胞。Western-blot和IFA分析结果显示,所表达的蛋白大小约25.4ku,能够与Asia 1型口蹄疫病毒标准兔抗血清发生特异性反应,证实所表达的蛋白具有较好的反应原性。结果表明,Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒pc-F构建成功,且能在BHK-21细胞中正确表达。     

口疮病毒dUTPase基因的原核表达及亚细胞定位

为了对口疮病毒(orf virus,ORFV)的dUTPase基因进行原核表达和亚细胞定位研究,本研究利用PCR扩增获得dUTPase基因,通过亚克隆获得重组表达质粒p ET-32a-dUTPase和p EGFP-C3-dUTPase。p ET-32a-dUTPase经IPTG诱导表达出dUTPase蛋白。蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多抗血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。p EGFP-C3-dUTPase转染BHK21细胞,利用荧光显微镜观察dUTPase蛋白的亚细胞定位。结果表明,dUTPase蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,分子质量大小约为35.7 ku,与预期相符。表达的dUTPase His融合蛋白能够与His标签的单克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。琼脂扩散试验结果显示抗体效价为1∶8。真核表达的dUTPase蛋白在转染的BHK21细胞中主要分布在细胞质中。本研究结果为进一步研究dUTPase蛋白的功能奠定了一定的理论基础。     

H3亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

山羊Viperin基因的克隆与真核表达载体的构建

本研究分离山羊外周血单核细胞,设计引物,采用RT-PCR方法扩增出Viperin基因完整阅读框。经BLAST分析,该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中已有序列的最高同源性均为99%。同时将不同物种(山羊、猪、人、小鼠)的氨基酸序列进行比对分析,发现N端结构域在不同物种间是高变区。然后,将目的基因酶切克隆入真核表达载体pc DNA3.1中构建重组表达质粒。经PCR、酶切和测序鉴定正确的阳性质粒分别被命名为pcDNA-g Vi HA和pcDNA-HAg Vi。使用脂质体Lipofectamine 2 000将重组质粒转染BHK21细胞,使用HA抗体进行间接免疫荧光检测,发现重组蛋白均得到表达,荧光分布于细胞质中;Western-blot结果表明,两个质粒转染后均可检测到分子量约为43 ku的条带。使用内质网标志物Calnexin抗体进行共聚焦检测,发现表达的Viperin蛋白与内质网存在共定位。上述研究结果为进一步研究山羊Viperin的抗病毒作用及其机制奠定了基础。     

微小隐孢子虫P23基因真核表达质粒在HeLa细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测

为观察微小隐孢子虫P23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用PCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行P23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-P23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-P23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫P23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-P23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-P23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-P23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫P23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。     

弓形虫ME49虫株α-微管蛋白对神经瘤母细胞自噬的影响

为研究刚地弓形虫α-微管蛋白(TgTUBA1)与神经瘤母细胞(N2a)自噬的关系,利用TgTUBA1基因的CDS序列设计引物并引入HA标签序列,提取弓形虫ME49虫株总RNA并反转录获得cDNA,以cDNA为模板进行PCR扩增,获得目的片段,并克隆至pcDNA3.1(+)载体上。将构建的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HA-TUBA1转染至N2a细胞内,通过透射电子显微镜和荧光显微镜观察自噬小体,并通过Western-blot检测LC3Ⅰ/Ⅱ的表达变化。结果显示,成功构建了pcDNA3.1(+)-HA-TUBA1真核表达载体,Western-blot试验检测到50 ku大小的特异目的条带。与空载体组相比,pcDNA3.1(+)-HA-TUBA1转染N2a细胞48 h后,N2a细胞皱缩、突触减少;观察到特征性的自噬小体;自噬相关蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ表达上调。本研究证明了TgTUBA1蛋白可以促进N2a细胞自噬现象的发生,这为宿主细胞抗弓形虫感染提供了新的研究思路。     

扬子鳄α型干扰素蛋白抗病毒活性分析

为了研究扬子鳄IFN-α抗病毒活性,构建真核表达载体pcDNA3.1-caIFN及pEGFP-N1-caIFN,将pc DNA3.1-caIFN转染至293T细胞中,通过间接免疫荧光试验证明IFN-α成功表达,并显示定位于细胞质中,第48小时扬子鳄IFN-α的表达量要高于第24小时的。将pEGFP-N1-caIFN转染至Vero细胞中,过表达24 h后接种水疱性口炎病毒(VSV),观察细胞,并在VSV感染后第24及48小时收集细胞,通过荧光定量PCR测定病毒VSV-G基因的变化,同时收集上清测定VSV子代病毒滴度,结果表明,与对照组相比,第24及48小时过表达扬子鳄IFN-α的试验组VSV-G基因的表达分别下调4倍及7倍,VSV子代病毒滴度分别低2.3及1.9个数量级。本研究结果证明,真核表达扬子鳄IFN-α蛋白能够抑制VSV mRNA的转录,并能抑制病毒增殖。     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。     

蓝舌病病毒NS3蛋白的截短表达及其多克隆抗体制备

首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病病毒1型(BTV1)NS3基因的截短片段,将其克隆至表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-NS3,转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后用IPTG诱导表达,可溶性分析显示,重组NS3蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达。纯化重组表达的NS3蛋白,免疫新西兰白兔制备抗NS3蛋白的多克隆抗体,利用免疫印迹和细胞免疫荧光试验检测该抗体的特异性及NS3蛋白在BTV感染细胞内的分布。结果显示,制备的抗NS3多克隆抗体不仅可与重组表达的NS3蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然NS3/NS3A蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞以及KC细胞中均检测到了NS3/NS3A蛋白的特异性表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组NS3蛋白并制备了相应的特异性抗体,为进一步研究NS3蛋白的特性和功能奠定了基础。     

鸡源IFIT5蛋白的体外表达及单克隆抗体的制备

鸡IFIT5(chIFIT5)蛋白在抗病毒免疫中具有重要作用。为了阐明其具体作用机制,本研究将禽传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)感染DF-1细胞后,通过RT-PCR方法扩增chIFIT5基因,将其构建到pET-28a(+)原核表达载体上进行表达,然后用纯化的重组chIFIT5蛋白免疫小鼠后通过细胞融合技术筛选能稳定分泌抗chIFIT5蛋白的单克隆抗体细胞株。结果显示,扩增获得的chIFIT5基因的大小为1 440 bp,在原核细胞中成功表达的重组chIFIT5蛋白约58 ku。Western-blot检测显示,有4株单抗与重组chIFIT5蛋白、IBDV感染的细胞中chIFIT5蛋白以及Myc-chIFIT5真核转染蛋白均能发生免疫反应,但间接免疫荧光(IFA)检测反应却均呈阴性。抗体亚类分析结果显示,四株细胞株所分泌的单克隆抗体均为Ig G 2a亚类,轻链均为κ链。这为鸡源IFIT蛋白的生物学特性研究奠定了基础。     

微小隐孢子虫类钙调蛋白基因真核表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达

为了构建微小隐孢子虫类钙调蛋白(calmodulin-like protein,CML)基因的真核表达质粒,并在Hela细胞中实现表达,以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,通过PCR扩增CML基因,插入到克隆载体pMD18-T中。对经鉴定的pMD-CML重组质粒进行双酶切,将目的基因连接到经同样内切酶双酶切的真核表达载体pVAX1上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用FuGENE HD转染试剂介导的方法,将重组表达质粒转染Hela细胞,用Western-blot技术和间接免疫荧光法检测外源基因的表达。结果显示,成功构建了微小隐孢子虫CML基因的真核表达质粒pVAX-CML,重组质粒在Hela细胞中实现了表达,表达产物具有良好的反应原性,为研究CML的特性和功能、寻找新的防控技术奠定了基础。