猪细环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

参考猪细环病毒1型(TTSuV 1)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV 1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测TTSuV 1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法标准曲线的决定系数为0.999 5,表明具有优良的线性关系;最低可精确检测63copies/μL的核酸模板;重复性试验的变异系数小于2%;对TTSuV 2、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等均检测不到荧光信号。对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV 1的检测与定量分析。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,经反应条件优化后,绘制的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR的标准曲线的线性关系显著(r20.999),平均试验间变异系数为0.26%;检测敏感性可达到2×101 copies/μL。应用该方法对人工感染坦布苏病毒的鸭组织进行的检测结果显示,从36份病料组织中检出35份为阳性,检出率为97%。结果表明,成功建立了检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR,该方法较常规PCR更快捷、敏感、准确,适用于坦布苏病毒临床样品的检测。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR方法的建立和应用

猪圆环病毒3型(PCV3)是近两年报道的一种新病毒,为实现快速检测PCV3的目的,笔者以我国PCV3全基因组为模板设计合成了1对引物和1条TaqMan探针,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。经过标准曲线分析、敏感性、特异性和重复性等一系列试验,表明该方法具有特异性强、敏感性高以及重复性好的特点。试验结果表明,阳性PCV3标准品DNA稀释10-8后(浓度为50 copies/L)仍然可以被检出,不同浓度的组间和组内重复性试验结果显示变异系数均小于3%,最后用36份临床样品进行了应用性评价,结果从中检测出9份阳性样品,表明所建立的方法是一种高效的可用于PCV3的分子诊断技术。     

猪脑心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立

针对猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1基因序列设计并合成了l对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测EMCV核酸的SYBR Green I real-time PCR方法.检测结果显示,该方法线性关系好,标准曲线的相关系数达到0.991;对初始模板的检出下限为1×101copies/μL,比常规PCR方法高100倍;与其他猪源病毒,如口蹄疫病毒(FMDV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于3%.应用建立的方法检测了17份临床可疑病例的心、脑组织样本,结果1份为阳性.表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于EMCV的病原检测及定量分析.     

牛轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速特异的定量检测牛轮状病毒的荧光定量PCR方法,本研究从牛轮状病毒NCDV株DNA中扩增的VP6基因片段(211 bp)并克隆于pMD19-T载体(p MD19-T-VP6)作为重组质粒标准品,建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果表明,VP6片段长211 bp,经鉴定所构建的重组质粒成功;用该质粒测得real-time PCR的最低检测量为15.39 copies/L。用该方法检测猪传染性胃肠炎病毒、牛细小病毒、猪流行性腹泻病毒及伪狂犬病病毒的结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的重复性。以上结果表明,本研究建立的基于VP6基因的牛轮状病毒qRT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等特点,可用于牛轮状病毒的早期诊断。     

绵羊IFN-γ和IL-2基因SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法的建立及应用

为探讨传染性脓疱病毒感染后机体的细胞免疫应答,从分子水平对传染性脓疱病毒的免疫机制进行了深入探讨。首先针对Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2以及管家基因GAPDH的mRNA序列分别设计了1对特异性引物,扩增相应的基因片段并构建含有相应基因序列的重组质粒,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了用于IFN-γ、IL-2及GAPDH检测的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法。该方法线性关系良好,IFN-γ、IL-2和GAPDH标准曲线的相关系数均达0.99以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达1×103copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性融解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用该方法对传染性脓疱病毒感染羔羊外周血白细胞中的IFN-γ、IL-2 mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,建立的real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点,可用于绵羊Th1型细胞因子的检测及定量分析。     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。     

鸡传染性支气管炎病毒real-time PCR检测方法的建立

针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N基因片段设计并合成了1对引物,将构建的重组质粒作为阳性标准品,成功建立了检测IBV核酸的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法。结果显示,该方法的线性关系好,标准曲线的相关系数达0.998 3;最低可以检测到1×101 copies/μL的核酸模板;与常见禽源病毒新城疫病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、马立克氏病病毒均不发生交叉反应,重复性试验的变异系数小于3%。应用建立的方法对人工感染IBV的20只试验鸡的40份气管和肾样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,攻毒后第5和第7天肾中病毒含量高于气管,证实了临床表现与病毒载量之间的关系。结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于IBV的病原检测及定量分析。     

牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。     

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已公布的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针,构建质粒标准品,以标准品为模板建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪库布病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和口蹄疫病毒为模板时均未检测到荧光信号,表明该方法具有良好的特异性;用2.66×10~6、2.66×10~5和2.66×10~4copies/L这3个不同浓度的质粒标准品进重复试验,循环阈值Ct的变异系数均低于2%,表明该方法具有良好的特异性;标准曲线斜率为-3.461,相关系数为R~2=0.998,表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品,检测的最低限度为2.66×10~1 copies/L的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对194份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示PDCoV阳性率为22.1%,明显高于常规RT-PCR的11.9%,表明该方法可应用于PDCoV的临床诊断及定量检测。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中的猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)S蛋白基因的保守序列设计合成1对特异性引物,经PCR扩增S基因并构建含有该基因片段的重组质粒,将该重组质粒作为阳性标准品,建立了检测HEV的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,相关系数为0.994;敏感性高,检测下限为1.6×104 copies/μL;特异性强,与牛冠状病毒、伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒不发生交叉反应;并且重复性好,组内、组间的变异系数均小于2%。应用该方法对采集的20份疑似HEV感染病料进行检测,其中16份为阳性,而用常规PCR检测同样的样品,仅8份为阳性。表明建立的SYBRGreen Ⅰ real-time PCR方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于临床上HEV的检测及定量分析。     

基于TaqMan探针的猪圆环病毒1型实时荧光定量 PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因,构建了重组质粒pMD-ORF2并将其作为标准阳性模板.通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF2为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立了检测PCV1的荧光定量PCR方法.结果显示,该方法的检测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL;对起始浓度为1.0×107、1.0×106、1.0×105拷贝/μL标准品的最终实际测得值分别为1.001×107、0.869×106和0.988×105拷贝/μL,变异系数分别为4.758%、1.865%和3.836%.表明,此方法具有良好的准确性和重现性.     

猪流感病毒一步法荧光定量RT-PCR诊断方法的建立

为了建立一种在猪流感流行病学调查和临床诊断中应用的快速高效的诊断方法,根据猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)M基因的保守序列,设计并合成1对特异性引物和1条特异性TaqMan探针,建立了以RNA为反应模板的一步法荧光定量RT-PCR诊断方法。使用含有M基因的重组质粒作为标准品绘制标准曲线,该曲线效率值为2.014,误差值为0.005。试验结果表明,该方法灵敏度极高,最低可检测到10 copies的核酸;临床样品检测结果也显示其灵敏度高于普通PCR和病毒分离法;特异性强,对猪群常见的其他6种病毒检测结果均为阴性。临床样品检测显示,该方法操作简单,可以用RNA作为模板直接检测,节省时间,而且特异性好、灵敏度高,是可以应用于猪流感流行病学调查的一种可靠的诊断方法。     

仔猪免疫PRRSV疫苗后病毒血症的荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗免疫后在猪体内病毒血症持续时间的方法。根据GenBank中PRRSV基因序列,设计1对针对N基因扩增的特异性引物,经RT-PCR扩增后连接到pMD19-T载体上,构建含有N基因片段的重组质粒。采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量RT-PCR扩增,建立标准曲线并进行特异性、敏感性及重复性试验,比较分析该方法与商品化试剂盒检测结果的阳性符合率。结果显示,所构建方法的扩增效率为1.063,标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值之间相关系数为0.999,引物特异性强,可检测的最低核酸模板浓度为1.0×10~2copies/L,比常规PCR敏感性高10倍,重复性试验的变异系数均小于1%,与商品化试剂盒检测的阳性符合率达100%。两种方法检测结果均表明,在猪体内PRRSV疫苗病毒血症可持续3周。本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,可为PRRSV感染(包括疫苗毒)的调查、监测和防控提供可行性和操作性强的技术支持。     

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立禽呼肠孤病毒(ARV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板,用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBR GreenⅠ染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感1×103倍,可检测到5.2×102个拷贝的标准品RNA,与NDVI、BDV、MG均不反应;从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒,病毒含量为1×105~1×107个拷贝/μL。表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于ARV的检测。     

猪圆环病毒2型基因型鉴别PCR检测方法的建立

采用PCR方法从猪圆环病毒2型(PCV2)山东分离株中扩增ORF2基因片段,结合GenBank中已登录的PCV2基因序列进行同源性分析及基因型鉴定,确定山东省PCV2的流行优势基因型,探讨PCV2基因的遗传变异特性。依据PCV2基因型间的差异性序列,设计、合成特异性PCR引物,建立PCV2基因型鉴别PCR检测方法,并从敏感性、特异性、重复性等方面评价其性能。结果,获得了28株PCV2ORF2完整基因,其中4株为PCV2a型,21株为PCV2b型,3株为新基因型PCV2d型,显示山东省流行的PCV2优势基因型为PCV2b。基因同源性分析表明,2000-2012年国内不同地区分离株的基因同源性为90.5%~99.8%,不同基因型PCV2存在一定形式的特有氨基酸位点序列。用建立的PCV2基因型鉴别PCR方法扩增的片段大小分别为341bp和177bp,该方法最低能检测病毒DNA的量为5ng/μL;特异性试验结果显示,该方法只对PCV2a和PCV2b的DNA扩增阳性,而对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)和大肠杆菌(Escherichia coli)的扩增结果均为阴性;重复检测10次的结果均一致。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性和重复性,可用于PCV2基因型的鉴别检测。     

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10~8～6.57×10~1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10~1copies/μL;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。     

PCV2型和PCV3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速、特异地鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,本研究根据PCV2和PCV3保守区域基因序列,采用Primer Express 6设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针。经过引物筛选和条件优化,建立可鉴别检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR方法。本方法能同时特异性地检测鉴别PCV2和PCV3,且与CSFV、PRV、ASFV、SVDV、FMDV、SVA病毒核酸没有交叉反应。本方法灵敏性强,PCV2和PCV3的最小检出量分别为48.1 copies/μL和58.3 copies/μL。组间和组内试验变异系数不超过1.5％,重复性好。结果表明,本研究创建了一种灵敏度高、特异性强的PCV2和PCV3双重荧光定量PCR方法。