牛肠道病毒北京株的分离鉴定及全基因组分析

采用RT-PCR方法从北京某牛场有腹泻症状牛的粪便样品中检测到牛肠道病毒(bovine enterovirus,BEV),分离出1株病毒并将其命名为BJ101。然后,通过电镜观察、全基因组序列测定和同源性分析,对该毒株进行了验证。结果,BJ101分离株在MDBK细胞上的TCID50为1×10-6.42/0.1 m L,电镜观察到病毒颗粒直径为25~30 nm,无囊膜,呈典型的小RNA病毒粒子形态;BJ101株的基因组长度为7 409 bp,其中5′非编码区(UTR)长812 bp,3′UTR长72 bp,病毒基因组开放阅读框(ORF)全长6 525 bp。对全基因组序列进行比对分析显示,在5′UTR区、编码区和3′UTR区,BJ101分离株与BEV E2型毒株的核苷酸相似性最高。基于VP1基因的系统进化树表明,BJ101株是BEV E2型的成员。上述结果丰富了国内牛肠道病毒的基因库,为BEV的诊断及预防奠定了良好的基础。     

犬瘟热病毒PS株的全基因组序列测定与遗传进化分析

对犬瘟热病毒(CDV)PS株基因组进行全基因组序列测定与分析,以阐明该毒株的基因特征与遗传进化情况。利用RT-PCR方法分段扩增PS株全基因组序列,分别将产物克隆入pMD18-T载体中并进行测序,将所测序列拼接获得CDV PS株的全基因组cDNA。用DNAStar软件比较PS株全基因组序列与国内外犬瘟热病毒疫苗株和野毒株全基因组序列的同源性,然后用Mega4.0软件进行系统进化分析。测序结果显示,PS株全基因组序列的长度为15 690nt,该基因组推导的某些氨基酸位点发生了突变。与GenBank中登录的国内外参考毒株的同源性比较结果显示,PS株基因组与MKY-KM08分离株的基因序列同源性高达97.9%,与其他毒株的同源性为93.0%～97.0%;与CDV3疫苗株和Onderstepoort疫苗株的同源性最低,分别为93.2%和93.0%。基于全基因组序列绘制的系统进化树表明,所有CDV分离株分为疫苗株和野毒株2支,PS株和MKY-KM08株位于同一支,属于亚洲1型。结果表明PS株为野毒株,其全基因组序列与MKY-KM08株的全基因组序列亲缘关系最近。     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HN-HW株全基因组分子特征分析

利用RT-PCR方法扩增得到猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)HN-HW分离株全长基因组的17个片段。拼接后发现该毒株基因组全长为15 334nt(包括poly A尾巴),与国内外14株美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于85.3%～99.4%之间,而与欧洲型PRRSV Lelystad Virus(M96262)和SD01-08(DQ489331)分离株全序列相似性仅为59.7%和59.9%。序列分析表明,该毒株包括189nt的5′UTR,14 981nt的蛋白编码区和150nt的3′UTR及14nt的poly(A)尾巴。同美洲标准株ATCC VR-2332相比,Nsp2存在30个氨基酸的缺失。本研究结果补充了PRRSV毒株的基因组信息数据,为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒FY株全基因组序列的测定及其分子特征的研究

根据小反刍兽疫病毒(PPRV)参考序列设计了11对特异性引物,然后用RT-PCR方法分段扩增出PPRV富阳分离株(PPRV-FY)的全基因组序列,用DNAstar软件和Mega软件对PPRV-FY株及参考毒株的基因序列进行了比对和分析,并根据N基因核苷酸序列绘制了系统进化树。结果,PPRV-FY株全长15 948 bp,编码6种结构蛋白(N、P、L、M、F和H),2种非结构蛋白(C和V),PPRV各毒株转录起始序列和转录终止序列都高度保守。同源性分析结果表明,PPRV-FY株与PPRV-Coted′Ⅰvoire89同源性最低,为89.0%,与PPRV/Tibet/30/2007株和PPRV/Tibet/2007株的同源性最高,为97.3%,其基因间隔区N-P长度一致,相似度最高,而M-F相似度最低。通过比较PPRV-FY株与参考毒株基因组末端调控序列,可以看出整个麻疹病毒属GP区和AGP区保守性较高,且存在不同程度的互补。氨基酸序列分析结果表明,PPRV-FY株在保守区域出现21处氨基酸突变,这些突变对其所编码蛋白的结构和功能有何影响尚需要进一步研究。此外,本文还基于N基因序列,对PPRV-FY株及参考毒株进行了系统进化分析。结果表明,PPRV-FY株与其它亚洲源PPRV野毒株共同形成一个拓扑群,属于第IV谱系。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

猪传染性胃肠炎病毒SY株的分离鉴定及S基因的序列分析

取沈阳地区某猪场表现为腹泻症状的病死仔猪小肠病料,无菌处理后接种在PK-15细胞上分离病毒。通过无限稀释法进行病毒纯化、病毒中和试验和RT-PCR检测,证实其为传染性胃肠炎病毒(TGEV),并命名为TGEV SY株。参照Gen Bank中TGEV序列设计引物,对SY株S基因进行RT-PCR扩增,克隆并测序,获得S基因组完全序列。将S基因序列和所编码的氨基酸序列与Gen Bank中登录的10个TGEV和1个PRCV S基因序列进行同源性和亲缘关系的比较分析。结果表明,SY株S基因核苷酸序列和编码的氨基酸序列与其他参考毒株的同源性分别为96.4%~99.2%和96.0%~97.9%;而与PRCV毒株的同源性分别为96.2%和96.6%。由系统进化树可知,SY株与国内的华毒株、TS株以及国外的Miller M60株位于进化树的同一分支,亲缘关系较近。总体来看,各毒株之间的S基因差异性不大,表明TGEV虽然处于不断遗传演化中,但不同毒株的S基因变异不是特别明显。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒HB09JY03株的分离鉴定及其全基因组序列分析

利用DF-1细胞系、ELISA群特异性抗原检测以及亚群特异性间接免疫荧光法,从湖北省某鸡场送检的海兰褐蛋鸡病料中分离鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为HB09JY03。为了解其分子特征,对其进行了全基因组测序,并与其他毒株进行了比较。结果表明,HB09JY03分离株的gag和pol基因非常保守,与各参考毒株的同源性为97.5%～99.0%;env基因的同源性为88.4%～97.5%;其3′UTR出现部分rTM区段缺失现象。与参考毒株相比,HB09JY03分离株与HPRS-103株的亲缘关系较近,可作为我国蛋鸡ALV-J株生物学特性和致病机制研究的良好材料。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南株HNxy的分离鉴定及遗传进化分析

为了解河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株的变异特性,本试验从河南省信阳市某疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪场采集的肺组织中分离到1株PRRSV,并命名为HNxy,该毒株能产生明显的细胞病变。全基因组进化分析和同源性比对分析结果显示,HNxy株与中国高致病性毒株位于同一分支;与欧洲型毒株Lelystad-virus同源性最低,仅为60.0%;与美洲型经典毒株VR-2332的同源性为89.2%;与中国高致病性毒株JXwn06、JXA1和HUN4的同源性分别为98.4%、98.3%和98.4%;HNxy与JXA1-P80同源性最高,为98.7%;与NADC30和NADC30-like毒株HENAN-HEB、JL580、CHsx1401同源性分别为84.6%、84.7%、87.3%和83.6%。NSP2序列比对结果显示,HNxy在高变区存在30个不连续氨基酸的缺失。GP5序列比对结果显示,HNxy在GP5抗原表位上有氨基酸的突变,结果表明,HNxy属于美洲型高致病性毒株疫苗株,且在抗原表位上有一定程度的突变。     

樱桃谷肉鸭源细小病毒QH-L01株的分离鉴定及VP1基因序列分析

2016年4月,四川邛崃某鸭场送检30只樱桃谷肉鸭,临床表现鸭喙变短、舌头伸出。从送检鸭脏器中分离鉴定出1株鸭源细小病毒,命名为QH-L01株。为进一步了解该病毒毒力及分子生物学特性,对其进行ELD50测定、VP1基因测序,并与其他细小病毒毒株进行比较。ELD50测定结果为10-6.54ELD50/0.2 m L;VP1核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,该病毒结构基因全长2 203 bp,编码734个氨基酸,与鹅细小病毒核苷酸同源性为92.8%~99.8%,与番鸭细小病毒同源性为77.4%~87.3%;VP1编码的氨基酸同源性和鹅细小病毒及番鸭细小病毒分别为95.2%~99.5%和85.4%~91.1%。VP1基因进化分析显示,该病毒和鹅细小病毒SYG26-35分离株处于同一进化分支上。动物回归试验结果显示,试验组出现明显的鸭源细小病毒BADS症状,对照组无明显变化,表明该病毒分离鉴定成功。     

猪源乙型脑炎病毒HEN0701株全基因组的分子特征

将乙型脑炎病毒HEN0701株基因组RNA分4段进行RT-PCR扩增,并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO载体中,测定全长cDNA序列。以MapDraw软件分析了乙型脑炎病毒HEN0701株的基因组结构,并将病毒基因组分成2个非编码区和10个基因,比较了HEN0701株和11株乙型脑炎病毒在全基因组和各基因的核苷酸及推导氨基酸的同源性。以MEGA5软件绘制HEN0701株和11株病毒C、E、NS3、NS5基因的进化树。结果显示,HEN0701株全基因组为10 965 nt,包含一长10 299 nt的开放阅读框。在核苷酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株的全基因组和各基因的同源性均高,而与GⅢ分离株则较低;而在氨基酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株在多聚蛋白和各病毒蛋白的同源性和HEN0701株与GⅢ分离株的相近。进化分析显示,不同基因进化树的拓扑结构相近,12株病毒的C、E、NS3、NS5基因进化方向相同,GⅠ分离株和GⅢ分离株间C基因进化距离最近。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及其基因组变异特征的研究

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在河南省新乡地区猪体内的进化情况,笔者对河南省新乡地区某猪场送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料进行了病毒的分离鉴定,并采用PCR扩增得到了该病毒的全基因组序列,同时对分离病毒株的GP5和NSP2序列进行了比对分析。结果显示:成功分离并鉴定出1株美洲型PRRSV(XX2015),与中国代表毒株CH-1a中的核苷酸同源性是92.8%,与高致病性(HP)-PRRS病毒代表株Hu N4、Hu B1、He Nan-1、He NAN-A14株的核苷酸同源性则分别为97.2%、97.0%、97.2%、94.4%。对基因组的进一步分析表明,该毒株GP5蛋白非中和性表位处存在氨基酸变异,NSP2蛋白在第481位、第485~488位、第533~561位共缺失34个氨基酸。XX2015分离株是HP-PRRSV的一个代表株,该病毒株在NSP2蛋白中存在跳跃性突变,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子进化提供了分子证据。     

2007-2011年广东省猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解广东省2007-2011年猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异情况,采用PCR方法对本实验室分离到的49株PCV2分离株进行全基因组克隆和序列分析。所分离的毒株全长分别为2株1 766bp、45株1 767bp、2株1 768bp。通过序列比对进行遗传变异分析,无论是这49株病毒间还是与GenBank中的8株PCV2基因组间的核苷酸同源性均为93.2%～99.9%;在遗传演化关系上,49株分离株分布于2个大群,分别为PCV2b和PCV2d分支。提示目前疫苗毒株不处于广东地区PCV2流行毒株分支中,应该引起高度的重视。     

山羊关节炎-脑炎病毒陕西分离株全基因组的克隆和序列分析

为了解山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)陕西分离株全基因组的特点及基因演化变化,根据Gen-Bank中登录的CAEV CO株的全基因组序列,设计合成了5对引物,对CAEV陕西株的全基因组进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了克隆和测序。结果显示,CAEV陕西株的基因组全长为9 065nt,获得的GenBank登录号为GU120138,包括两端的长末端重复序列,结构蛋白编码基因gag、pol、env和调节蛋白编码基因tat和rev,以及辅助蛋白编码基因vif。核苷酸序列比对表明,CAEV陕西株和CAEV甘肃株的同源性为99.6%,与CAEV CO株的同源性为92.4%,根据全基因组序列和gag基因序列构建的遗传进化分析结果显示,CAEV陕西分离株属于SRLV B2亚型。     

23株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列差异分析

用RT PCR及测序获得了 17株猪瘟病毒 (HCV) 2 5 1bp的E2基因主要抗原编码区序列 ,经DNAstar软件对获得的 17株HCV及已发表的 6株HCV毒株序列进行了比较和分析 ,并构建了HCV遗传发生树。结果 ,这 2 3株与石门株的序列相比 ,所有毒株的碱基变化随机地分布于整个序列 ,无缺失和插入 ,其中变化较大的区域位于序列的 3′端。 2 3株HCVE2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别为 74.1%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 % ,其中 4株 2 0世纪 70～ 80年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 76.3 %～ 86.2 %、81.1%～ 87.8% ,10株 2 0世纪 90年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 75 .4%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 %。所绘制的遗传发生树分为 2个组群 (group) ,每个组群分为 2个亚组群 (subgroup) ,14株猪瘟 (HC)流行毒株在 2个组群中均有分布 ,2 0世纪 70～ 80年代分离的 3株 (75 % )在组 群 2 ,2 0世纪 90年代分离的 5株 (5 0 % )在组群 1     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒 (IBDV )YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析 ,并和相关毒株进行了比较。结果表明 ,YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有 92 .5 %和 91.8% ,与超强毒株UK6 6 1的核苷酸和氨基酸同源性均为97.6 % ,而与当地鸡群中分离的超强毒株HN94 2的核苷酸和氨基酸同源性则高达 98.1%和98.4 % ,该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。     

猪圆环病毒2型山东株全基因组的克隆与序列分析

参照国外发表的猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)全基因组序列,设计合成了1对特异性引物,从山东疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病料中提取PCV2基因组DNA,进行PCR扩增.回收PCR产物,将其插入pMD18-T载体,构建了重组质粒pMD18-T-PCV2,并对筛选出的阳性质粒进行测序.结果表明,克隆得到的PCV2山东株的全基因组长为1 767 bp.应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中登录的国内外PCV毒株进行同源性比较.结果显示,PCV2山东株与国内外毒株的核苷酸同源性高达99.6%,推导的氨基酸同源性达95.4 %.进化树分析结果显示,PCV2山东株与GZ(EF515839)株同源性最高,表明,PCV2各分离毒株在进化方面存在地域上的相关性.     

猪伪狂犬病病毒MQ18变异株的分离鉴定

为了解福建省猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的病原学特性及分子遗传变异情况,本研究用羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)从疑似暴发伪狂犬病猪场死亡的育肥猪中分离到1株病毒,该病毒能够产生典型的PRV细胞病变,病毒液接种小鼠(0.1 mL/只)及成年兔(0.5 mL/只)在48～60 h死亡,均表现出典型的伪狂犬病症状。经PCR试验、电镜观察及特异性血清间接免疫荧光试验鉴定为伪狂犬病病毒,命名为MQ18株;并对其进行病毒效价的测定及gC、gE基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示,分离株TCID50为10~(-7.71)/0.1 mL;将其gC和gE基因序列与国内外17个PRV参考毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性分别为93.5%～99.9%和97.8%～100%,氨基酸序列同源性分别为88.7%～99.8%和95.7%～100%;分子遗传进化树分析显示,gC和gE基因均与国内近6年分离的PRV变异株集聚在一起,属于同一个进化分支;与经典株相比,gC基因编码的氨基酸序列在第63～69位有1个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,gE基因编码的氨基酸序列分别在第48位和第496位有1个天冬氨酸(D)的插入,与PRV变异株变异位点相一致。以上结果证实,从发病猪群中分离到1株PRV变异株,本研究结果为选择合适疫苗来防控猪伪狂犬病以及病原学研究提供了参考。     

猪源伪狂犬病病毒福建龙岩分离株的鉴定及其TK基因和gE基因的分子特征

从福建省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养等方法证实该病毒为伪狂犬病病毒(PRV)野毒株,并命名为Fujian-LY株。对其主要毒力基因TK和gE的分子特征和遗传进化关系进行分析,结果表明,Fujian-LY株TK基因与参考序列的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.5%~99.8%和98.1%~99.4%;gE基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.6%~99.8%和95.5%~99.3%。氨基酸多序列比对发现,Fujian-LY株TK基因在2个位点发生了独特性的氨基酸突变,即第16位氨基酸由K→R和第129位氨基酸由S→G。其中,第16位氨基酸突变导致TK蛋白ATP结合结构域由-G**G*GK-转变为-G**G*GR-。gE氨基酸序列最具特征性的变化是第48位和第496位各有1个天冬氨酸(D)的插入,该插入特征为PRV变异毒株的重要标志。遗传进化树分析结果表明,Fujian-LY株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的亲缘关系较近,属于近年来流行的PRV变异毒株,而与PRV经典株的亲缘关系相对较远。